Pim-3 Rabbit mAb

目录号: F0808

Filter:

  • WB
  • IHC
  • Lane 1: KARPAS-299
    Lane 2: A20
    Lane 3: YB2/0
1/2
规格 价格 库存 购买数量
20ul 790 现货
50uL 1240 现货
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操作要点

蛋白定位:细胞质
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件:200 mA, 60 min

使用信息

稀释比例
1:1000
1:100 - 1:500
1:100 - 1:500
抗体应用
WB, IHC, IF
抗体类型
Rabbit
反应性
Human, Mouse, Rat
储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
预测分子量
35 kda
阳性对照 KARPAS-299; A20; YB2/0; COS-7 (transfected with Pim-3)
阴性对照 COS-7 (untransfected)

样品处理数据示例

样品 处理情况
COS-7 Transfection (m Pim-3)
点击查看更多样品数据

*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考:http://www.proteinatlas.org

实验方法

WB
实验步骤:
 
样品制备
1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
 
转膜
1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜)。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件:200 mA, 60 min。(电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
 
封闭
1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:1000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤:
 
标本制备
1. 吸出液体,然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意:多聚甲醛有毒,只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液,用 1X PBS 冲洗 3 次,每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液,加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中,室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果,请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存,请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 
IHC
实验步骤:
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片:
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次,每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次,每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次,每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
6.抗原修复:对于柠檬酸盐:将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中,在微波炉中加热,直至开始沸腾; 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液,并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液,用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次,每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次,每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要,用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
15. 切片脱水:95%乙醇孵育切片两次,每次 10 秒; 在 100% 乙醇中重复,孵育切片两次,每次 10 秒; 在二甲苯中重复,孵育切片两次,每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Datasheet & SDS

生物描述

特异性

Pim-3 Rabbit mAb 可检测总 Pim-3 蛋白的内源水平。 它不会与其他 Pim 家族成员发生交叉反应。

Uniprot ID
Q86V86
克隆号
H6L6
背景

Pim 蛋白,包括 Pim-1、Pim-2 和 Pim-3,是癌基因编码的丝氨酸/苏氨酸激酶。 Pim-3,最初被称为 Kid-1,被发现是一种通过 PC-12 细胞去极化上调的蛋白质。 它具有磷酸化 Bad 的能力,从而阻止 Bad 诱导的细胞凋亡。 已在多种癌症中检测到 Pim-3 表达异常,例如肝癌、胰腺癌、结肠癌和胃癌。

参考文献

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