PML Rabbit mAb

目录号: F2539

  • Lane 1: 293T
    Lane 2: K562
    Lane 3: HeLa
    Lane 4: A549
规格 价格 库存 购买数量
20uL 790 现货
50uL 1240 现货
100uL 1990 现货
100uL*2 3790 现货
更大包装 有超大折扣 点击询价
 

400-668-6834

info@selleck.cn

 

操作要点

蛋白定位: 细胞质, 内质网, 胞内体, 内膜, 细胞核
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。

使用信息

稀释比例
1:1000
1:70
1:2000
1:500
抗体应用
WB, IP, IHC, IF
抗体类型
Rabbit
反应性
Human
储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
预测分子量
98 kDa
阳性对照 Human mammary gland; Human breast carcinoma; Human fetal brain; Human fetal heart; Human fetal kidney; HeLa; A549; HAP1; HEK293; K562
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤:
 
样品制备
1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
 
转膜
1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜)。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件:200 mA, 120 min。(电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
 
封闭
1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:1000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤:
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片:
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次,每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次,每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次,每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
6.抗原修复:对于柠檬酸盐:将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中,在微波炉中加热,直至开始沸腾; 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液,并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液,用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次,每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次,每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要,用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
15. 切片脱水:95%乙醇孵育切片两次,每次 10 秒; 在 100% 乙醇中重复,孵育切片两次,每次 10 秒; 在二甲苯中重复,孵育切片两次,每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF

实验步骤:

样品准备
1. 贴壁细胞:取洁净无菌盖玻片置于培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞:将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片:将玻片置于室温下解冻,纯水或 PBS 摇洗 3次,每次 3 min。
4. 石蜡切片:先将玻片脱蜡至水,纯水或 PBS 摇洗 3次,每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次,每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂,如 0.1~0.3% Triton X-100,室温通透 10~20 min。
(仅针对胞内抗原,若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。)
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次,每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液,在室温下封闭至少 1 h。(常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。)
注意事项:从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润,避免干燥,否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色(第一天)
1. 吸走封闭液,滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色(第二天)
1. 吸走一抗,PBST 摇洗 3 次,每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗,PBST 摇洗 3 次,每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI,室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次,每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片,将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性

PML Rabbit mAb 用于检测内源性 PML 总的蛋白水平。

别名
PML,PML Protein
Uniprot ID
P29590
克隆号
F17K6
背景

早幼粒细胞白血病蛋白 (PML) 是一种 RING 指 IFN 诱导的肿瘤抑制因子,定位于称为 PML 核体 (NB) 的核结构。它在各种组织中表达,在造血细胞中含量较高,其表达受细胞因子、应激信号和细胞分化的调控。从结构上看,PML 包含一个 RING-B-box-coiled-coil (RBCC) 基序,该基序由 C3HC4 锌指、B-box 和卷曲螺旋结构域组成,对二聚化和核体组织至关重要。从功能上看,PML 通过调控涉及 p53 和其他凋亡信号的途径来维持基因组稳定性、调控细胞凋亡并抑制肿瘤发生。在急性早幼粒细胞白血病 (APL) 中,PML 与 RARα 形成融合蛋白,破坏正常的 PML 功能和核体完整性,导致肿瘤发生。

参考文献

技术支持

在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段,您遇到的任何问题,均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834,或者技术支持邮箱tech@selleck.cn,直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。

* 必填项

请输入您的姓名
请输入您的邮箱地址 请输入一个有效的邮箱地址
请写点东西给我们
在线咨询
联系我们