Rac1 + Rac2 + Rac3 Rabbit mAb
目录号: F2364
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Lane 1: C6
Lane 2: RAW 264.7
Lane 3: PC-12
Lane 4: NIH/3T3
操作要点
蛋白定位：细胞质; 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-218 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 21 kDa |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Rac1 + Rac2 + Rac3 Rabbit mAb 用于检测内源性 Rac1 + Rac2 + Rac3 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| Rac1/2/3 |
| 克隆号 |
|---|
| G9P16 |
| 背景 |
|---|
Rac 和 Cdc42 是 Rho-GTPase 家族的成员，Rac 在哺乳动物中以三种亚型存在：Rac1、Rac2 和 Rac3。这些亚型具有高度的序列相似性。Rac1 和 Cdc42 是研究最广泛的，并且普遍表达，而 Rac2 则特定于造血细胞。Rac3 虽然主要在脑中表达，但也存在于其他各种组织中。Rac 和 Cdc42 是多种细胞过程的关键调控因子，包括细胞骨架重组、膜运输、转录、细胞生长和发育。它们的活性受其结合和水解 GTP 的能力调控。与 GTP 结合会激活 Rac 和 Cdc42，而内在 GTPase 活性会将 GTP 水解为 GDP，从而将它们转换为非活性状态。 GTPase 激活蛋白 (GAP) 可增强此水解过程，而鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 可促进 GDP 与 GTP 的交换，从而重新激活蛋白质。此外，鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子 (GDI) 可通过稳定 Rac 和 Cdc42 的无活性 GDP 结合形式提供另一层调控。 |
| 参考文献 |
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