SNAP29 Rabbit mAb
目录号: F2724
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Lane 1: HeLa
Lane 2: 293
Lane 3: Jurkat
操作要点
蛋白定位：细胞质; 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-233 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF, FCM |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
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| 29 kDa |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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SNAP29 Rabbit mAb 用于检测内源性 SNAP29 总的蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| P6H21 |
| 背景 |
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SNAP29（突触体相关蛋白 29）是一种普遍表达的 SNARE（可溶性 NSF 附着蛋白受体）蛋白，参与对细胞内运输、自噬和细胞稳态至关重要的膜融合过程。从结构上讲，SNAP29 包含两个 SNARE 基序，可与其他 SNARE 蛋白相互作用以促进膜融合，以及一个 N 端 NPF（天冬酰胺-脯氨酸-苯丙氨酸）基序，可结合 EHD1 等内吞衔接子，增强其在膜运输中的作用。与其他 SNAP 家族成员不同，SNAP29 缺乏棕榈酰化位点，导致其与膜和细胞质定位的短暂关联。 SNAP29 在各种组织中表达，包括大脑、皮肤和肝脏，并通过与 Syx17 和 Vamp7 共同介导自噬体与溶酶体的融合，在自噬中发挥重要作用。它对于维持高尔基体形态和调控内吞和外排也至关重要，其功能丧失会导致囊泡分泌过多等缺陷。SNAP29 突变与 CEDNIK 综合征有关，这是一种影响皮肤和神经系统发育的罕见先天性疾病，突显了其在细胞和组织完整性中的重要性。 |
| 参考文献 |
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