A-Raf Antibody (Rabbit mAb) [M11A1]
目录号: F6397
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HT29, Lane 2: A375, Lane 3: Hela, Lane 4: Raji
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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68 kDa
68 kDa, 67 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human fetal brain tissue; Human ovarian carcinoma tissue; Human kidney tissue; Rat stomach tissue; Mouse brain tissue; Mouse stomach tissue; Rat brain tissue; HeLa cells; PC-3 cells; NIH/3T3 cells |
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| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| A-Raf Antibody (Rabbit mAb) [M11A1] 可检测内源性 A-Raf 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
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| P10398 |
| 克隆号 |
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| M11A1 |
| 别名 |
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| ARAF1, PKS, PKS2, ARAF, Serine/threonine-protein kinase A-Raf, Proto-oncogene A-Raf, Proto-oncogene A-Raf-1, Proto-oncogene Pks |
| 背景 |
|---|
| A-Raf (ARAF) 是 Raf 家族中的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与 B-Raf 和 C-Raf 一样具有典型的 Ras-Raf-MEK-ERK 信号通路结构，但其 MEK 激酶活性较低，且具有显著的非激酶依赖性支架功能，能够调节细胞凋亡、代谢和内吞运输。该蛋白具有保守的 Raf 结构域架构，其 N 端包含一个 Ras 结合域和一个富含半胱氨酸的结构域，二者协同作用结合 Ras-GTP 和磷脂膜；中央富含丝氨酸/苏氨酸的调控区段包含磷酸化位点和 14-3-3 结合基序，用于控制自身抑制和激活；C 端催化结构域具有双叶激酶折叠，当 A-Raf 参与 MAPK 信号通路时，该结构域负责 MEK 的磷酸化。在MAPK级联反应中，A-Raf响应Ras激活而从胞质溶胶转位至质膜，以并排Raf二聚体的形式促进MEK激活，并参与传递促有丝分裂和分化信号；然而，比较研究表明，在所有Raf亚型中，A-Raf的MEK靶向激酶活性最低，且新近数据表明，它通常作为ERK输出的调节因子发挥作用，而非主要的MEK激活因子。除了其经典作用外，A-Raf还能直接结合促凋亡激酶MST2，并在不依赖自身激酶活性的情况下抑制MST2介导的信号通路，从而在多种癌症中发挥非经典的抗凋亡功能，并将A-Raf定位为MST2肿瘤抑制通路的调节因子。这种MST2相互作用受亚细胞定位调控：在增殖的正常细胞和肿瘤细胞中，A-Raf主要定位于线粒体，并能有效螯合MST2；而在分化的上皮细胞中，A-Raf重新分布至质膜，失去螯合MST2的能力，从而允许MST2激活和细胞凋亡。KSR2作为支架蛋白，在细胞分化过程中调控A-Raf的区室化。A-Raf还与代谢调节因子相关：与丙酮酸激酶M2 (PKM2) 的相互作用促进其构象向四聚体高活性状态转变，从而将A-Raf与癌细胞中糖酵解通量的调控以及更广泛的能量代谢调控联系起来。进一步的研究表明，A-Raf参与内吞膜转运。Ras和受体酪氨酸激酶驱动A-Raf募集至富含磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的膜上，从而向内体传递信号并激活ARF6（一种调节内吞作用的小GTP酶），这进一步拓展了A-Raf作为膜转运枢纽支架蛋白的作用。在癌症生物学中，A-Raf通过抑制MST2依赖性细胞凋亡和调节ERK信号通路促进肿瘤发生：由hnRNP H控制的剪接维持的全长A-Raf抑制MST2，而A-Raf表达或定位的改变影响ERK激活，并通过重塑Raf二聚体组成和下游MEK-ERK信号通路参与Raf抑制剂的耐药性。 |
| 参考文献 |
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