Aconitase 1/ACO1 Antibody (Rabbit mAb) [K17A22]
目录号: F8312
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2, Lane 2: TT, Lane 3: U20S, Lane 4: Hela
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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98 kDa
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| 阳性对照 | Human fetal liver tissue; HepG2 cells; T.T cells; U20S cells; HeLa cells; HEK-293 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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Aconitase 1/ACO1 Antibody (Rabbit mAb) [K17A22] 可检测内源性 Aconitase 1/ACO1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞质 |
| Uniprot ID |
|---|
| P21399 |
| 克隆号 |
|---|
| K17A22 |
| 别名 |
|---|
| IREB1, ACO1, Cytoplasmic aconitate hydratase, Aconitase, Citrate hydro-lyase, Ferritin repressor protein, Iron regulatory protein 1, Iron-responsive element-binding protein 1, IRP1, IRE-BP 1 |
| 背景 |
|---|
乌头酸酶1 (ACO1)，又称胞质乌头酸酶或铁调节蛋白1 (IRP1)，是乌头酸酶家族的双功能成员，它通过根据其铁硫簇的状态在酶促乌头酸酶状态和RNA结合调节状态之间切换，将中间代谢与铁稳态联系起来。该蛋白包含一个[4Fe-4S]簇，该簇嵌入一个多结构域支架中，其中一个铁原子位于一个暴露于溶剂的口袋中，使得该簇在催化过程中能够与柠檬酸和顺式乌头酸直接相互作用，并为其对铁可用性和氧化修饰的敏感性奠定了结构基础。 ACO1以全酶形式存在，其携带完整的[4Fe–4S]簇，催化柠檬酸经由顺式乌头酸可逆异构化为异柠檬酸，整合到胞质三羧酸循环延伸段，并影响柠檬酸-异柠檬酸的代谢通量，从而支持NADPH的生成和乙酰辅酶A的供应，用于生物合成途径。铁硫簇的丢失或解体使ACO1转化为脱辅基形式，发生构象重排，暴露RNA结合位点，从而能够高亲和力识别编码铁蛋白、转铁蛋白受体和其他铁处理蛋白的mRNA非翻译区中的铁反应元件（IRE）。 IRP1/ACO1与铁蛋白mRNA中的IRE结合抑制其翻译，而与转铁蛋白受体mRNA中的IRE相互作用则稳定转录本并支持受体的持续合成，从而建立起一个转录后调控回路，根据细胞内铁水平调节铁的储存和摄取。铁的可用性和Fe-S簇生物合成的变化会改变乌头酸酶和IRE结合状态之间的平衡，因此，充足的铁有利于催化性乌头酸酶构象并引导柠檬酸盐的流动，而铁的耗竭或Fe-S簇组装的破坏则促进RNA结合形式，并增强对铁转运和储存基因表达的调控。活性氧和活性氮，包括超氧化物和过氧化氢，会氧化Fe-S簇并触发其解体，从而降低乌头酸酶的催化活性并增强IRP1型调控行为，表明ACO1也作为氧化还原和炎症状态的传感器，这些状态与铁代谢密切相关。在脂肪组织中，ACO1表达和活性的调控通过改变异柠檬酸脱氢酶的表达、NADPH/NADP比值和转铁蛋白受体水平来影响脂肪生成能力，从而将其代谢和铁调节作用与维持脂肪能量代谢和铁吸收联系起来。在通路层面，ACO1位于柠檬酸循环、铁转运和储存系统以及氧化应激反应之间的关键节点，其发生Fe-S依赖性构象转变的结构能力为研究细胞如何在生理和疾病状态下协调ATP生成、生物合成需求和铁处理提供了一个机制框架。 |
| 参考文献 |
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