AF532 Rat IgG2b kappa Isotype Control Antibody [eB149/10H5]

固定
1. 如果染色细胞内抗原，首先按细胞表面流式细胞术染色方案操作进行细胞表面抗原染色。然后，每管加入0.5 mL固定缓冲液，室温避光固定20分钟。
2. 350g离心5分钟，弃去上清液；
注意：胞内染色通常在表面染色后进行，以避免固定/破膜步骤破坏表面抗原表位。

破膜
3. 将固定后的细胞重悬于胞内染色破膜洗涤缓冲液，350g离心5–10分钟；
4. 重复步骤3两次。

胞内染色
5. 将固定/破膜后的细胞重悬于残留的少量胞内染色破膜洗涤缓冲液中，加入预先确定的最佳浓度的目标荧光偶联抗体（例如：PE标记的抗IFN-γ抗体）或相应的阴性对照抗体。室温避光孵育20分钟；
6. 用2 mL胞内染色破膜洗涤缓冲液洗涤，350g离心5分钟。洗涤两次；
7. 若胞内一抗是生物素化的，需要进行荧光偶联链霉亲和素孵育。用胞内染色破膜洗涤缓冲液洗涤；
8. 将固定并完成胞内染色的细胞重悬于0.5 mL细胞染色缓冲液中，使用适当的对照组上机分析。

注意：为确认抗细胞因子染色的特异性，推荐进行阻断实验。细胞固定/破膜后，先与过量未标记的抗细胞因子抗体预孵育。或先将重组的目标细胞因子与荧光偶联的抗细胞因子抗体预孵育，再将此混合物加入细胞。

全血样本的活化与胞内染色
1. 将肝素化全血与无菌的组织培养液按1:1比例稀释；
2. 此阶段可进行抗原或有丝分裂原介导的体外细胞刺激。如需染色胞内细胞因子或趋化因子（例如：IFN-γ或IL-4），必须加入高效的蛋白转运抑制剂，如布雷菲德菌素A（brefeldin A）或莫能菌素（monensin）。加入合适的细胞活化剂后，将200 μL全血细胞悬液分装至12×75 mm塑料管中，在37°C、5% CO₂条件下孵育4–6小时；
3. 加入2 mL红细胞裂解液，室温孵育5–10分钟；
4. 350g离心5分钟，弃去上清液；
5. 用细胞染色缓冲液洗涤细胞1次。按细胞表面流式细胞术染色方案进行细胞表面免疫荧光染色；
6. 按上述第一部分（固定）、第二部分（破膜）和第三部分（胞内染色）的步骤进行细胞的固定、破膜和胞内抗原染色。

细胞表面流式细胞术染色
1. 待染色细胞用细胞染色缓冲液重悬，用细胞染色缓冲液将总体积补充至约15 mL，350g离心5分钟，弃去上清液。
2. 对活细胞进行计数，用细胞染色缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为5–10×10⁶ cells/mL，将细胞悬液以每管100 μL（每管含5–10×10⁵个细胞）的量分装到12×75 mm的流式管中。

封闭Fc受体:
封闭Fc受体有助于减少非特异性免疫荧光染色。

使用抗体进行细胞表面染色:
3. 按预先确定的最佳浓度加入荧光偶联抗体、生物素偶联抗体或纯化的一抗，冰上避光孵育15–20分钟；
4. 用至少2 mL细胞染色缓冲液洗涤2次，以350g离心5分钟。

使用抗体进行转录因子染色:
5. 最后一次洗涤后，弃上清，轻柔涡旋样品以分散细胞沉淀。
6. 每个孔中加入200 μL（微孔板）或1 mL（5 mL管）细胞固定液，轻柔吹打以确保细胞完全重悬。室温避光孵育45–60分钟。
7. 室温下300–400g离心5分钟，弃去上清液。轻柔涡旋震荡以分散细胞沉淀。
8. 每孔加入200 μL（微孔板）或2 mL（5 mL管）破膜缓冲液。
9. 室温下300–400g离心5分钟，弃去上清液。轻柔涡旋震荡以分散细胞沉淀。
10. 重复步骤8–9两次。总共使用破膜缓冲液进行3次洗涤。
11. 适量体积破膜缓冲液重悬细胞，每孔加入适量用破膜缓冲液稀释的荧光偶联抗体，室温避光孵育至少30分钟。
12. 每孔加入200 μL或2 mL（5 mL管）破膜缓冲液。
13. 室温下300–400g离心5分钟，弃去上清液。轻柔涡旋震荡以分散细胞沉淀。
14. 重复步骤12–13两次。总共使用破膜缓冲液进行3次洗涤。
15. 适量体积的细胞染色缓冲液重悬细胞，上机检测。