AF700 Human CD279/PD-1 Antibody [EH12.2H7]

组织样本或细胞样本准备:
1. 待检测的组织样本（如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓等）用细胞染色缓冲液制成单细胞悬液。如果检测样本是体外刺激的细胞，将刺激后的细胞用细胞染色缓冲液重悬，然后进行第2步；
2. 用细胞染色缓冲液将总体积补充至约15 mL，350g离心5分钟，弃去上清液。

裂解红细胞:
3. 需要裂解红细胞的组织（例如脾脏），用3 mL红细胞裂解液重悬沉淀，冰上裂解5分钟；
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间；
4. 加入10 mL细胞染色缓冲液终止裂解。350g离心5分钟，弃去上清液；
5. 重复步骤2的洗涤操作；
6. 对活细胞进行计数，用细胞染色缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为5–10×10⁶ cells/mL，将细胞悬液以每管100 μL（每管含5–10×10⁵个细胞）的量分装到12×75 mm的流式管中。

封闭Fc受体:
封闭Fc受体有助于减少非特异性免疫荧光染色。
7. 对于小鼠样品，建议使用对FcγR III/II具有特异性的抗小鼠CD16/32抗体。在100 μL体系中，每10⁶个细胞加入0.25 μg抗小鼠CD16/32抗体，冰上预孵育5–10分钟；
8. 对于人源样品，可在每100 μL细胞悬液中加入5 μL人Fc受体封闭液，室温孵育5–10分钟。若无有效/可用的封闭抗体，可用与免疫荧光染色所用抗体同种属、同型别的过量无关纯化Ig封闭细胞。

使用抗体进行细胞表面染色:
9. 按预先确定的最佳浓度加入荧光偶联抗体、生物素偶联抗体或纯化的一抗（例如抗CD3-FITC、抗CD4-Biotin和抗CD8-APC），冰上避光孵育15–20分钟；
10. 用至少2 mL细胞染色缓冲液洗涤2次，以350g离心5分钟；
11. 如果使用纯化的一抗，则将沉淀用残留缓冲液重悬，并加入预先确定的最佳浓度的抗种属免疫球蛋白荧光偶联二抗（例如FITC标记的抗小鼠Ig），冰上避光孵育15–20分钟；
12. 重复步骤10；
13. 用0.5 mL细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并加入5 μL（0.25 μg）/百万个细胞的7-AAD活力染色溶液排除死细胞；注意避免光谱重叠；
14. 冰上避光孵育3–5分钟；
15. 进行荧光激活细胞分选（FACS）或流式细胞术分析。

注意：如果您无法立即上机检测，请将样品避光并置于4–8℃的冰箱中，样品应重悬于细胞染色缓冲液中。请注意，不要将样品长时间放置于固定缓冲液中，因为这会影响荧光基团构象和荧光强度。