Aggrecan Antibody [D23A4]
目录号: F1599
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Recombinant Human Aggrecan Protein
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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261 kDa
250 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Recombinant human Aggrecan protein; C-terminal 10 His tagged Human Aggrecan recombinant protein (aa 20 to 675) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Aggrecan Antibody [D23A4] 可检测内源性 Aggrecan 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞外基质，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
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| P16112 |
| 克隆号 |
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| D23A4 |
| 别名 |
|---|
| AGC1, CSPG1, MSK16, ACAN, Aggrecan core protein, Cartilage-specific proteoglycan core protein, Chondroitin sulfate proteoglycan core protein 1, CSPCP, Chondroitin sulfate proteoglycan 1 |
| 背景 |
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| 聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是一种属于凝集素家族的硫酸软骨素蛋白聚糖，是软骨细胞外基质的主要结构和功能成分。它通过与胶原蛋白和其他基质蛋白协同作用，组织水合大分子聚集体，从而支持骨骼发育、承载能力以及维持关节和脊柱的结构。其核心蛋白包含三个球状结构域和连接糖胺聚糖的区域；N端G1结构域结合透明质酸和连接蛋白，形成大型多价蛋白聚糖聚集体；富含糖胺聚糖的结构域携带致密的硫酸软骨素和硫酸角质素链，形成高电荷、渗透活性网络，能够吸引水分子并抵抗压缩力；C端结构域则有助于基质的组织和分泌效率。聚集蛋白聚糖在基质信号传导环境中发挥作用，它与透明质酸和连接蛋白的相互作用稳定软骨细胞周围的细胞周围和细胞间基质结构，塑造影响软骨细胞代谢活动的力学微环境，并与II型胶原纤维整合，从而决定组织在重复机械负荷下的刚度和弹性。聚集蛋白聚糖的合成与其被基质金属蛋白酶和ADAMTS家族聚集蛋白酶切割之间的平衡控制着该网络的完整性；核心蛋白特定位点的蛋白水解事件会解离聚集体，降低固定电荷密度，并削弱软骨维持肿胀压力的能力，从而改变关节生物力学并易于导致进一步的基质损伤。聚集蛋白聚糖的表达和结构域组织也参与软骨和生长板成熟的发育过程，其中透明质酸结合区和糖胺聚糖结合区的调控性存在与软骨细胞的增殖和肥大相一致，并有助于骨骼的正常模式形成。在骨关节炎软骨中，基质中聚集蛋白聚糖的消耗及其碎片在滑液中的积累与组织退化的早期阶段相关，而聚集蛋白聚糖酶和金属蛋白酶活性的升高则将炎症介质和机械负荷与进行性基质丢失联系起来；与此同时，聚集蛋白聚糖的产生仍然是修复反应的关键特征，包括依赖于重建致密蛋白聚糖网络以恢复正常组织功能的基于细胞的软骨修复策略。 |
| 参考文献 |
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