Aggrecan Antibody (Rabbit mAb) [M12J8]
目录号: F5574
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A375
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议曝光 60s 以上。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：250 mA, 180 min。
建议曝光 60s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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261 kDa
600 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | A-375 cells (PNGaseF treated); Hs 822.T cells (PNGaseF treated); Hs 822.T cells; A-375 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Hep G2 cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Aggrecan Antibody (Rabbit mAb) [M12J8] 可检测内源性 Aggrecan 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞外基质，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P16112 |
| 克隆号 |
|---|
| M12J8 |
| 别名 |
|---|
| ACAN, AGC1, AGCAN, aggrecan, Aggrecan core protein, Aggrecan core protein 2, CSPCP, CSPG1, CSPGCP, large aggregating proteoglycan, MSK16, PGCA, SEDK, SSOAOD |
| 背景 |
|---|
| 由ACAN基因编码的聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是一种大型的硫酸软骨素蛋白聚糖，属于凝集素家族，在生长板和关节软骨中高表达，并与II型胶原蛋白共同构成软骨细胞外基质的主要非胶原结构成分。其核心蛋白包含三个球状结构域（G1、G2和G3），这些结构域之间由富含硫酸软骨素和硫酸角质素链的延伸区域隔开；N端G1结构域与连接蛋白具有相似的结构基序，可结合透明质酸和连接蛋白形成大型三元聚集体；中央G2结构域与G1/连接重复序列同源，参与产物加工；C端G3结构域则调节糖胺聚糖的修饰、分泌以及与其他基质分子的相互作用。 G2 和 G3 之间的富含糖胺聚糖的结构域携带多条硫酸软骨素和硫酸角质素链，形成带高负电荷的梳状聚电解质。嵌入胶原网络中的聚集蛋白聚糖-透明质酸聚集体形成水合凝胶，该凝胶能够吸收水分，产生膨胀压力，并提供软骨在关节活动过程中抵抗压缩负荷所需的渗透压和力学性能。通过透明质酸依赖性聚集以及其 G3 结构域与细胞外基质 (ECM) 伙伴（如腱生蛋白、纤连蛋白和原纤维蛋白）的相互作用，聚集蛋白聚糖能够组织细胞周围和细胞内基质，并促进软骨细胞-基质和软骨细胞-软骨细胞之间的相互作用，从而影响发育过程中的软骨骨骼形态发生以及成熟后关节软骨结构的维持。在中枢神经系统中，聚集蛋白聚糖存在于神经元周围网状结构中，它与透明质酸、连接蛋白和腱生蛋白结合，在神经元周围形成致密的细胞外基质结构。在此过程中，它调节神经细胞外空间的组织，并参与控制发育可塑性和损伤反应。改变核心蛋白结构或糖胺聚糖连接的ACAN基因突变与身材矮小、骨骼发育不良以及关节和脊柱发育异常相关，这与聚集蛋白聚糖在生长板功能和软骨模式形成中的核心作用相一致。在骨关节炎和相关退行性关节疾病中，软骨中的聚集蛋白聚糖丢失是一个早期且突出的事件，聚集蛋白聚糖核心蛋白被ADAMTS-4和ADAMTS-5等聚集蛋白酶以及基质金属蛋白酶切割，产生特定的片段，这些片段从组织中扩散出来，降低蛋白聚糖含量，导致承重能力下降和软骨生物力学改变。 |
| 参考文献 |
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