AHA1 Antibody (Rat mAb) [L18K15]
目录号: F4529
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Hela
操作要点
本抗体需使用抗大鼠二抗。
WB湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, ELISA |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
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| Rat Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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38kDa
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| 阳性对照 | Mouse backskin; HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| AHA1 Antibody [L18K15] 可检测内源性 AHA1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，内质网 |
| Uniprot ID |
|---|
| O95433 |
| 克隆号 |
|---|
| L18K15 |
| 别名 |
|---|
| AHSA1, AHA1, HSPC322, p38, C14orf3, LOC10598, Activator of Hsp90 ATPase activity 1, Activator of 90 kDa heat shock protein ATPase homolog 1 |
| 背景 |
|---|
| AHA1（AHSA1；Hsp90 ATPase 激活因子 1）是一种保守的辅助伴侣蛋白，它能与分子伴侣 Hsp90 结合，并作为其 ATPase 活性最有效的内源性加速剂发挥作用，从而调节 Hsp90 依赖的底物蛋白在多种细胞通路中的折叠、稳定和成熟过程的动力学和结果。该蛋白由一个 N 端结构域和一个 C 端结构域组成。N 端结构域与 Hsp90 的中间结构域对接，而 C 端结构域则与 N 端 ATPase 结构域接触。这种双向相互作用促进 Hsp90 的构象转变，从而增强 ATP 结合，加速 ATP 水解，并稳定伴侣蛋白循环的封闭催化活性状态。 AHA1通过刺激Hsp90的ATPase活性，缩短底物蛋白在特定分子伴侣状态下的停留时间，并改变包含其他辅助伴侣蛋白（如p23、Hop和Cdc37）的Hsp90复合物之间的平衡。这使得AHA1成为Hsp90调控激酶、转录因子以及其他参与细胞增殖、存活和分化的信号蛋白的关键决定因素。AHA1与包含多个底物和调控因子的大型Hsp90中心异质蛋白复合物结合，其表达水平影响致癌底物（包括酪氨酸激酶、类固醇激素受体和细胞周期调节因子）的成熟和稳定性，从而将AHA1活性升高与多种肿瘤类型中增强的促生存信号传导和治疗耐药性联系起来。在神经元系统中，AHA1通过调节Hsp90的分子伴侣功能和降解决策，参与处理易聚集蛋白，例如tau蛋白和亨廷顿蛋白。在阿尔茨海默病、亨廷顿病和其他蛋白质病相关的神经退行性疾病模型中，均报道了AHA1丰度或活性的改变，这些疾病会导致蛋白质稳态受损。AHA1可以直接结合应激变性蛋白，并在缺乏Hsp90的情况下延缓其聚集，这表明AHA1具有自主的分子伴侣活性，从而扩大了其在应激条件下对细胞蛋白质质量控制的影响。AHA1还参与Dicer1的生物合成和功能，进而影响microRNA的成熟，这在其对分子伴侣依赖性蛋白质组的影响之外，又增加了一层转录后基因调控机制，并将AHA1与调控细胞身份、癌变转化和神经元韧性的通路联系起来。癌症和神经退行性疾病中 AHA1 表达失调与客户处理紊乱和疾病进展相关，而 Hsp90-AHA1 相互作用的小分子破坏剂或 AHA1 功能抑制剂通过重新平衡 Hsp90 客户网络在实验模型中显示出疗效。 |
| 参考文献 |
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