AIM2 Antibody (Mouse mAb) [C10K13]
目录号: F6260
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A549, Lane 2: MCF7
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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39 kDa
48.2 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | A549 cells; MCF-7 cells; HeLa cells; AIM2 (aa1-195) recombinant protein |
|---|---|
| 阴性对照 | HEK293 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| AIM2 Antibody (Mouse mAb) [C10K13] 可检测内源性 AIM2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞质，炎症小体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| O14862 |
| 克隆号 |
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| C10K13 |
| 别名 |
|---|
| Interferon-inducible protein AIM2, Absent in melanoma 2, AIM2 |
| 背景 |
|---|
| AIM2（黑色素瘤缺失2）是一种干扰素诱导的PYHIN家族胞质传感器，能够检测胞质中异常的双链DNA，并组装一个多蛋白炎症小体平台，将基因组和病原体来源的DNA信号与caspase激活、细胞因子成熟和炎症性细胞死亡联系起来。该蛋白包含一个N端pyrin结构域，介导与衔接蛋白ASC的同型相互作用；以及一个C端HIN200结构域，以序列非依赖的方式结合双链DNA，使AIM2能够在胞质DNA达到一定长度后形成更高级的复合物。识别双链DNA后，HIN结构域与DNA骨架结合，促进AIM2沿DNA支架寡聚化，进而驱动pyrin结构域聚集，并将ASC募集到螺旋丝状结构中，这些螺旋丝状结构作为procaspase-1组装和激活的平台。活化的 caspase-1 将 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 切割成成熟的分泌形式，并加工 Gasdermin D 以触发细胞焦亡，从而确立了 AIM2 作为先天免疫反应的关键上游组分，该反应针对来自弗朗西斯菌属、李斯特菌属、分枝杆菌属、巨细胞病毒、痘苗病毒、曲霉菌属和疟原虫属等病原体的胞质 DNA。AIM2 炎症小体的组装依赖于高级丝状结构而非简单的化学计量复合物，调控因子可以调节丝状体的成核和稳定性，从而调节炎症小体激活的阈值和动力学。AIM2 与 ASC 的结合还可以募集并激活 caspase-8 以及 caspase-1，使得同一个炎症小体平台能够驱动凋亡和焦亡途径。较低剂量的双链DNA (dsDNA) 更倾向于caspase-8依赖性细胞凋亡，而较高剂量的DNA则更迅速地激活caspase-1介导的细胞焦亡，这表明AIM2控制着细胞死亡方式的剂量依赖性转换。AIM2还具有不依赖于炎症小体的功能，包括在结直肠癌模型中调节肠道干细胞增殖和肠道菌群组成，这使得AIM2成为肿瘤抑制和上皮稳态的一个因素，其表达能够限制过度增殖信号。AIM2对自身DNA的活性失调会导致自身免疫和自身炎症性疾病，例如银屑病、皮炎和关节炎，在这些疾病中，对内源性胞质DNA的异常识别会导致慢性IL-1β/IL-18产生和持续的炎症损伤。在癌症中，AIM2 表现出依赖于环境的影响：缺失或表达降低可解除对干细胞增殖的控制，并支持结直肠肿瘤的发展，而异常的 AIM2 炎症小体活性可在其他情况下创造促肿瘤的炎症微环境。 |
| 参考文献 |
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