Akt1 Antibody (Rabbit mAb) [B17F18]
目录号: F4135
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Akt1 proteins, Lane 2: Akt2 proteins, Lane 3: Akt3 proteins
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
实际分子量
|
|---|
|
55 kDa
60 kDa
|
| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human T-cell non-Hodgkin's lymphoma; Human ovarian carcinoma; Mouse embryonic fibroblast cell pellets, Human prostate carcinoma; LNCaP cells (LY294002-treated); HeLa cells; Akt1 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Akt1 Antibody [B17F18] 可检测内源性 Akt1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞质，内膜系统，线粒体，细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P31749 |
| 克隆号 |
|---|
| B17F18 |
| 别名 |
|---|
| AKT; AKT serine/threonine kinase 1; AKT1; AKT1 kinase; AKT1m; MGC99656; PKB; PKB alpha; PKB-ALPHA; PRKBA; Protein kinase B; Protein kinase B alpha; RAC-PK-alpha |
| 背景 |
|---|
| Akt1（也称为蛋白激酶Bα）是AGC家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，作为磷脂酰肌醇3-激酶下游的中心信号枢纽，整合生长因子、细胞因子和营养物质的输入，从而协调调控细胞存活、增殖、代谢和生长。该蛋白包含一个N端pleckstrin同源结构域，可与质膜上的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸结合；一个具有保守激活环苏氨酸的中心催化激酶结构域；以及一个C端调节尾，该调节尾包含一个疏水基序丝氨酸和其他残基，这些残基可调节其活性以及与上游激酶和磷酸酶的相互作用。当受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体或其他受体刺激I类PI3K生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PI3K）时，激活过程开始。PI3K通过其pleckstrin同源结构域将Akt1及其上游激酶PDK1募集到细胞膜上；PDK1磷酸化激活环上的苏氨酸残基，而mTOR复合物2磷酸化C端疏水基序上的丝氨酸残基，二者共同作用使Akt1获得完全的催化活性。蛋白磷酸酶如PP2A和PHLPP可逆转这些磷酸化，而PTEN及相关脂质磷酸酶则通过使PI3K去磷酸化间接抑制Akt1，从而在激酶和磷酸酶活性之间建立平衡，决定Akt1信号的强度和持续时间。 Akt1激活后，可磷酸化多个细胞区室中含有RxRxxS/T基序的底物，包括促凋亡的Bcl-2家族成员Bad、FoxO转录因子以及内源性caspase机制的组成部分，从而将信号通路转向促进细胞存活并增强对凋亡诱导的抵抗力。Akt1还通过AS160和糖酵解调节因子等靶点调控代谢和营养物质的利用，通过抑制GSK-3亚型将胰岛素和生长因子信号与葡萄糖转运和糖原合成偶联，并通过磷酸化p21和p27来影响它们的稳定性和定位，从而调控细胞周期进程。Akt1对TSC2以及TSC1-TSC2-mTOR轴其他元件的直接磷酸化，将Akt1与mTOR复合物1的激活、eIF4F的组装和蛋白质合成联系起来，使该激酶处于生长和合成代谢信号网络的核心。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
