ANKRD1 Antibody (Mouse mAb) [C18F2]
目录号: F5778
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse heart
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF, ELISA |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, Pig, Rabbit |
| 抗体类型 |
|---|
| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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36 kDa
36 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse heart tissue; A431 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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| ANKRD1 Antibody (Mouse mAb) [C18F2] 可检测内源性 ANKRD1 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
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| Q15327 |
| 克隆号 |
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| C18F2 |
| 别名 |
|---|
| Ankyrin repeat domain-containing protein 1; Cardiac ankyrin repeat protein; Cytokine-inducible gene C-193 protein; Cytokine-inducible nuclear protein; ANKRD1; C193, CARP, HA1A2 |
| 背景 |
|---|
| ANKRD1编码心脏锚蛋白重复序列蛋白（CARP），这是一种应激诱导的转录共抑制因子，是位于心肌肌节I带的肌联蛋白-N2A机械感觉信号复合物的组成部分，CARP定位于肌节结构中，负责感知肌纤维的机械拉伸。响应机械拉伸，CARP从该肌节复合物转位至细胞核，在那里抑制肌节基因的转录。CARP的表达本身可被心肌肥大和心力衰竭诱导，从而建立了一条拉伸激活的反馈通路：机械负荷增加首先提高CARP水平，然后驱动CARP介导的编码收缩性肌节蛋白的基因表达抑制。对扩张型心肌病患者的 ANKRD1 进行测序，发现杂合错义突变，并且对这些突变 CARP 蛋白进行生化表征表明，特定的氨基酸替换破坏了 CARP 与其肌节伴侣的结合：一种突变消除了 CARP 与 Talin-1 和 FHL2 的结合，而另一种突变仅消除了与 Talin-1 的结合，并且表达这些突变 CARP 蛋白的细胞与野生型 CARP 相比，表现出拉伸诱导基因表达的改变，尽管突变蛋白保留了正常的细胞内定位，这表明这些突变损害了 CARP 的分子相互作用和下游信号输出，而不是将蛋白质从其在细胞内的正常位置移位。由于这些 ANKRD1 突变在一定比例的扩张型心肌病患者中被发现，并且会在不破坏 CARP 亚细胞定位的情况下，导致可测量的牵张依赖性基因调控缺陷，因此它们支持这样一种模型：通过这种肌联蛋白相关牵张感应复合物传递的心脏机械转导遗传功能障碍，是部分扩张型心肌病病例发病机制的促成因素。这种牵张感应作用也使 CARP 成为更广泛的机械转导通路中的一个汇聚点，这些通路将机械超负荷与心脏肥大和心力衰竭中常见的转录重塑联系起来，而不仅仅局限于在心肌病患者中发现的特定遗传突变。 |
| 参考文献 |
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