Annexin A10/ANXA10 Antibody (Rabbit mAb) [J2G3]
目录号: F8010
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: BxPC-3, Lane 2: Mouse stomach, Lane 3: Rat stomach
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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37 kDa
35 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human stomach tissue; Mouse stomach tissue; Rat stomach tissue; BxPC-3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Annexin A10/ANXA10 Antibody (Rabbit mAb) [J2G3] 可检测内源性 Annexin A10/ANXA10 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UJ72 |
| 克隆号 |
|---|
| J2G3 |
| 别名 |
|---|
| ANX14, ANXA10, Annexin A10, Annexin-10, Annexin-14 |
| 背景 |
|---|
| Annexin A10 (ANXA10) 是 Annexin A 家族中一种能结合钙离子和磷脂的蛋白，其表达具有组织特异性，并在胃肠道和肝胆组织中发挥调节上皮分化和肿瘤进展的作用。该蛋白具有保守的 Annexin 核心结构域，该结构域由重复的 Annexin 结构域组成，介导 Ca²⁺ 依赖性的磷脂结合；此外，其独特的 N 端区域有助于其在胃上皮细胞中定位于细胞核，并与调控细胞周期进程和细胞存活的信号通路分子相互作用。在正常成人肝脏中，表达一种短链肝脏特异性亚型（ANXA10S）。肝细胞癌中ANXA10S的下调与血管侵犯、早期复发和预后不良相关，尤其是在与p53突变同时存在时。这表明，充足的ANXA10表达能够抑制侵袭性生长，而ANXA10的缺失与p53通路破坏协同作用，加速肿瘤进展。在多种物种的胃黏膜中，ANXA10蛋白特异性表达于胎儿和成人胃上皮以及布伦纳氏腺，并在肠化生区域普遍缺失，这使其成为一种胃分化标志物，其存在可区分胃型上皮和化生肠型黏膜。对大量胃癌样本的免疫组织化学分析显示，约一半的肿瘤表达ANXA10，其中弥漫型和混合型胃癌的表达率较高，而肠型胃癌的表达率则低得多；在弥漫型胃癌中，ANXA10阳性与较低的肿瘤分期、较少的淋巴结转移和较好的五年生存率相关，而在肠型胃癌中，ANXA10表达与较高的肿瘤分期和较差的生存率相关，揭示了ANXA10在不同亚型肿瘤生物学中的作用。在口腔鳞状细胞癌中，ANXA10 mRNA和蛋白的表达水平相对于正常黏膜上调，siRNA介导的ANXA10敲低可通过抑制ERK信号通路和诱导G1期阻滞，并伴随细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的上调来降低细胞增殖，这表明ANXA10可通过调控MAPK/ERK通路作为肿瘤细胞增殖的指标和驱动因子。 Annexin A10 也影响乳头状甲状腺癌的细胞凋亡和应激反应：ANXA10 及其结合伴侣 TSG101 在癌细胞系中表达上调；ANXA10 敲低抑制细胞增殖、促进细胞凋亡并抑制 MAPK/ERK 信号通路；而 TSG101 过表达则逆转这些效应，表明 ANXA10 与 TSG101 结合并维持 MAPK/ERK 通路活性，从而支持甲状腺肿瘤的生长。在胰腺癌前病变和浸润性胰腺导管腺癌中，ANXA10 在 PanIN、IPMN 和 PDAC 的导管上皮细胞中持续过表达，但在正常导管和大多数慢性胰腺炎中则不表达；在高级别肿瘤中，ANXA10 与 CD24 共表达与向 PDAC 的进展相关，支持将其用作导管转化和癌前病变进展的早期标志物。据报道，在结直肠癌和其他癌症中，ANXA10 敲低可通过干扰自噬介导的 TFRC 降解来诱导铁死亡，并通过限制 EMT 相关通路（如 PLA2G4A/PGE2/STAT3）来减少转移，进一步突显了其通过特定信号轴控制增殖、存活、迁移和 EMT 的机制作用。 |
| 参考文献 |
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