Aquaporin 2 Antibody [N16N24]

目录号: F3703

抗体应用：反应性：Mouse, Rat, Human

Lane 1: Mouse kidney

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议曝光 90s 以上。

使用信息

稀释比例
WB1:500 IP1:30 IHC1:4000

抗体应用
WB, IP, IHC

反应性
Mouse, Rat, Human

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
28 kDa

阳性对照	Human kidney tissue; Rat kidney tissue; Human fetal kidney; Mouse kidney tissue
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。

IHC
实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

IHC

实验步骤：

脱蜡/补液

1. 脱蜡/水合切片：

2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。

3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。

4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。

5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。

5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。

6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。

7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。

9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。

11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。

12. 将载玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用苏木精复染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。

16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Aquaporin 2 Antibody [N16N24] 可检测内源性 Aquaporin 2 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，胞质囊泡，高尔基体，内膜系统

Uniprot ID
P41181

克隆号
N16N24

别名
Aquaporin‑2; AQP‑2; ADH water channel; Aquaporin‑CD; Collecting duct water channel protein; WCH‑CD; Water channel protein for renal collecting duct; AQP‑CD; AQP2

背景
水通道蛋白2 (AQP2) 是主要固有水通道蛋白家族的成员，主要存在于肾脏集合管的主细胞中，它调控跨上皮水的重吸收，以维持全身体液和电解质的平衡。AQP2 形成同源四聚体，每个单体包含六个跨膜螺旋和两个胞外环，形成一个狭窄的沙漏状孔道，该孔道选择性地允许水通过，偶尔也允许尿素等小分子溶质通过。其主要机制依赖于血管加压素 (AVP) 与基底外侧 V2 受体的结合，激活腺苷酸环化酶以提高 cAMP 水平，从而刺激蛋白激酶 A (PKA) 磷酸化 AQP2 C 端尾部的 Ser256 位点；这会通过抑制RhoA和涉及Rab11阳性循环内体的转运事件触发肌动蛋白解聚级联反应，迅速将AQP2囊泡转运至顶端膜，从而使水通透性提高100倍以上。在高渗应激下，p90RSK对Ser261位点的磷酸化作用会抵消这一效应；而当AVP撤离时，钙调磷酸酶的去磷酸化作用则会使AQP2在细胞内循环，确保cAMP-PKA-AQP2转运轴的动态调控，该轴与前列腺素E2和钙信号通路整合，从而对水合状态做出精细调节。该通路在脱水期间能够发挥抗利尿作用，浓缩尿液以维持血浆渗透压，并使AQP2成为研究膜蛋白转运、血管加压素信号传导保真度或在肾脏生理模型中进行水通道调节剂高通量筛选的研究人员的重要靶点。通过突变破坏运输或磷酸化而导致的失调会损害水分保留，导致肾性尿崩症伴多尿，而上调则会导致 SIADH 中的低钠血症。

背景

水通道蛋白2 (AQP2) 是主要固有水通道蛋白家族的成员，主要存在于肾脏集合管的主细胞中，它调控跨上皮水的重吸收，以维持全身体液和电解质的平衡。AQP2 形成同源四聚体，每个单体包含六个跨膜螺旋和两个胞外环，形成一个狭窄的沙漏状孔道，该孔道选择性地允许水通过，偶尔也允许尿素等小分子溶质通过。其主要机制依赖于血管加压素 (AVP) 与基底外侧 V2 受体的结合，激活腺苷酸环化酶以提高 cAMP 水平，从而刺激蛋白激酶 A (PKA) 磷酸化 AQP2 C 端尾部的 Ser256 位点；这会通过抑制RhoA和涉及Rab11阳性循环内体的转运事件触发肌动蛋白解聚级联反应，迅速将AQP2囊泡转运至顶端膜，从而使水通透性提高100倍以上。在高渗应激下，p90RSK对Ser261位点的磷酸化作用会抵消这一效应；而当AVP撤离时，钙调磷酸酶的去磷酸化作用则会使AQP2在细胞内循环，确保cAMP-PKA-AQP2转运轴的动态调控，该轴与前列腺素E2和钙信号通路整合，从而对水合状态做出精细调节。该通路在脱水期间能够发挥抗利尿作用，浓缩尿液以维持血浆渗透压，并使AQP2成为研究膜蛋白转运、血管加压素信号传导保真度或在肾脏生理模型中进行水通道调节剂高通量筛选的研究人员的重要靶点。通过突变破坏运输或磷酸化而导致的失调会损害水分保留，导致肾性尿崩症伴多尿，而上调则会导致 SIADH 中的低钠血症。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23584881/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19966308/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%