ATP5A Antibody (Rabbit mAb) [H6A8]
目录号: F8999
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2, Lane 2: HeLa, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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60 kDa
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| 阳性对照 | Human liver tissue; Human fetal heart tissue; Rat kidney tissue; Mouse kidney tissue; Mouse brain tissue; Rat brain tissue; Human fetal liver tissue; Human fetal lung tissue; HeLa cells; MCF7 cells; HepG2 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| ATP5A Antibody (Rabbit mAb) [H6A8] 可检测内源性 ATP5A 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，内膜系统，线粒体，线粒体内膜 |
| Uniprot ID |
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| P25705 |
| 克隆号 |
|---|
| H6A8 |
| 别名 |
|---|
| ATP5A, ATP5A1, ATP5AL2, ATPM, ATP5F1A, ATP synthase F1 subunit alpha |
| 背景 |
|---|
| ATP5A（ATP5F1A），又称ATP合酶F1亚基α，是核编码、线粒体定位的复合物V亚基，构成ATP合酶全酶催化F1头部的一部分，对氧化磷酸化驱动的ATP合成至关重要。它既是β催化亚基的结构支架，也是调节旋转催化过程中核苷酸结合和释放的调控元件。线粒体ATP合酶的F1部分由三个α亚基和三个β亚基交替排列在中央γ轴上，此外还有δ亚基和ε亚基。牛F1的初级结构和化学计量学研究表明，α亚基与β亚基的同源性较弱，位于非催化核苷酸结合位点，并参与β活性位点与旋转轴之间的构象耦合。近期对人类ATP5F1A变体的结构建模证实，α亚基在β催化位点附近存在一个与β亚基相互作用的表面，该表面的电荷分布和几何结构对复合物的稳定性和功能至关重要。在氧化磷酸化过程中，电子传递链产生的质子动力势驱动Fo c环和中心茎的旋转，同时α3β3六聚体发生一系列构象变化，交替结合ADP和无机磷酸盐，催化ATP的生成并释放产物。ATP5F1A通过结合非催化核苷酸并将机械能传递给β亚基参与其中，α-β相互作用的缺陷会损害旋转耦合和ATP输出。致病性 ATP5F1A 变异体说明了该界面的功能重要性：反复出现的从头 Arg207His 替换在 α 的 β 相互作用表面上，靠近 β 活性位点，产生异常的负电荷区域，导致复合物 V 组装缺陷、ATP 合成减少、新生儿高乳酸血症和高氨血症，以及缓解性临床病程，症状在 18 个月时明显消退；而其他显性负性错义变异体则导致持续性发育迟缓、神经运动障碍和生化复合物 V 缺陷，表明 ATP5F1A 结构的细微变化可以产生一系列线粒体脑病。早期对两名患有致命性新生儿线粒体脑病的兄弟姐妹的复杂 V ATP5A1 缺陷的研究表明，杂合 ATP5A1 突变与母系等位基因沉默相结合，使 ATP5A1 表达降低至正常水平的一半左右，破坏了 α-β 相互作用，降低了复合物 V 的含量和活性，而用野生型 ATP5A1 进行互补可以恢复患者成纤维细胞中复合物 V 的功能，证实 ATP5A 对于全酶的稳定性是必不可少的，并且剂量效应足以引起严重的疾病。除了其经典的生物能量功能外，ATP5A1 还参与癌细胞的转录和转录后调控。在癌细胞中，ATP5A1 的异常表达和选择性剪接与癌基因调控的改变和肿瘤进展密切相关。此外，诸如线粒体酸 5 等小分子对 ATP 合酶的调节作用，例如促进 ATP 合酶寡聚化并改善线粒体疾病模型中的存活率，凸显了靶向含 ATP5A 复合物治疗能量代谢紊乱的治疗意义。近期预印本研究表明，特定的胞质 RNA 可以结合线粒体外膜上的 ATP5A1 前体蛋白并促进其输入，从而为 ATP5A 的生物合成增加了一层核糖调控机制，并提示 RNA 介导的输入失调可能导致复合物 V 的缺陷。 |
| 参考文献 |
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