β Amyloid (Aβ) 1-42 Antibody [N17C24]
目录号: F4733
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Recombinant Human β APP42 Protein(His&GST)
操作要点
WB
建议曝光 120s 以上。
建议曝光 120s 以上。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IF |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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87 kDa
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| 阳性对照 | Tg2576 Mouse model of Alzheimer's brain; Human Aβ-42 peptides; Human Aβ-43 peptides |
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| 阴性对照 | Mouse model of Alzheimer's brain; Human Aβ-37 peptides; Human Aβ-38 peptides; Human Aβ-39 peptides; Human Aβ-40 peptides |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| β Amyloid (Aβ) 1-42 Antibody [N17C24] 可检测内源性 β Amyloid (Aβ) 1-42 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 淀粉样蛋白，细胞膜，细胞突起 |
| Uniprot ID |
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| P05067 |
| 克隆号 |
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| N17C24 |
| 别名 |
|---|
| A4, AAA, ABETA, Abeta40, Abeta42, ABPP, AD1, AICD-50, AICD-57, AICD-59, AID(50), AID(57), AID(59), Alpha-CTF, APP, APPI, Beta Amyloid, Beta-APP40, S-APP-alpha, S-APP-beta, Soluble APP-alpha, Soluble APP-beta, testicular tissue protein Li 2 |
| 背景 |
|---|
| β-淀粉样蛋白 (Aβ) 1-42 是淀粉样前体蛋白 (APP) 的 C 端肽片段，由 β-分泌酶在细胞外/腔侧和 γ-分泌酶在跨膜区对 APP 进行连续蛋白水解切割而产生。Aβ 1-42 属于 APP 衍生的 Aβ 肽家族，该家族的肽段会在脑实质和血管壁中聚集。Aβ1-42 序列在 C 端比 Aβ1-40 长两个氨基酸残基，具有更高的疏水性，并且更倾向于自组装成低 n 寡聚体、原纤维和纤维，这些纤维形成富含交叉 β 折叠的构象，并在阿尔茨海默病病理中构成神经炎性斑块的纤维核心。 APP加工过程中，促进淀粉样蛋白生成β/γ通路的改变会增加Aβ1-42的产生。许多家族性阿尔茨海默病患者的APP或早老素基因突变会使Aβ谱向Aβ1-42绝对水平升高和Aβ1-42/Aβ1-40比值升高的方向转变，这与早期淀粉样蛋白沉积和斑块负荷相关。Aβ1-42与多种神经元和胶质细胞表面受体及结合蛋白相互作用，包括NMDA受体、细胞朊蛋白、尼古丁乙酰胆碱受体和RAGE，并调节涉及Ca²⁺内流、激酶激活和突触受体转运的细胞内信号级联反应。可溶性寡聚体形式的Aβ1-42通过特定的信号通路抑制海马长时程增强作用（LTP）并改变突触可塑性。该通路包括caspase-3激活、Akt活性降低和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）活性升高，从而将Aβ1-42暴露与突触强化受损和tau蛋白磷酸化相关改变联系起来。Aβ1-42还影响非神经元细胞；它激活小胶质细胞和星形胶质细胞，诱导促炎细胞因子和活性氧的产生，并通过模式识别受体和下游炎症通路改变小胶质细胞的存活和吞噬功能，从而导致持续的神经炎症环境。在生理水平上，低浓度的Aβ（包括Aβ1-42）参与突触活动和可塑性的调节、神经发生的调控以及抗菌防御，这表明Aβ肽具有依赖于浓度、聚集状态和环境的特定正常功能。在阿尔茨海默病中，生化和生物标志物分析发现 Aβ1-42 的产生、聚集和清除发生改变是其核心特征；脑脊液中可溶性 Aβ1-42 减少和斑块中积累可作为诊断标志物，并且 Aβ 通路稳态失衡与 tau 病理、神经免疫激活和神经递质失衡在疾病进程中相互作用。 |
| 参考文献 |
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