DAB2 Antibody (Rabbit mAb) [K17C17]
目录号: F5394
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (KO DAB2), Lane 3: Caco-2, Lane 4: PC-3
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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82 kDa
95 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human placenta tissue; Rat kidney tissue; Mouse kidney tissue; Human bladder cancer tissue; PC-3 cells; Caco-2 cells; HeLa cells |
|---|---|
| 阴性对照 | LNCaP cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| DAB2 Antibody (Rabbit mAb) [K17C17] 可检测内源性 DAB2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 包被小窝，细胞质，胞质囊泡，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P98082 |
| 克隆号 |
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| K17C17 |
| 别名 |
|---|
| DOC2, DAB2, Disabled homolog 2, Adaptor molecule disabled-2, Differentially expressed in ovarian carcinoma 2, Differentially-expressed protein 2, DOC-2 |
| 背景 |
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| 残疾同源物 2 (DAB2/DOC-2) 是一种多模块网格蛋白相关衔接蛋白，主要定位于质膜近端内吞机制和囊泡区室，在那里它将选定的货物受体和信号蛋白连接到网格蛋白介导的内吞作用以及控制细胞定位、上皮-间质转化以及免疫和肿瘤细胞行为的信号通路。该蛋白质包含一个 N 端磷酸酪氨酸结合域，可识别 NPXY 基序并与 Wnt 和其他信号复合物的成分相互作用；一个中心区域，具有多个与网格蛋白、磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸和含 EH 结构域的内吞辅助蛋白结合的基序；以及一个 C 端富含脯氨酸的片段，可与 GRB2 等 SH3 结构域适配器和其他支架结合，从而为组装货物-外壳-信号复合物创造了一个多功能平台。作为一种网格蛋白相关分选蛋白，DAB2 同时结合于质膜内侧的 PtdIns(4,5)P2、网格蛋白以及含有 NPXY 结构域的受体，包括 LDL 受体、整合素 β1、巨蛋白/LRP2、CFTR 和 TGF-β 受体，从而将这些货物募集到网格蛋白包被小窝中，并控制它们的内吞作用、向早期或晚期内体的转运以及再循环或降解。这些内吞功能延伸至多种受体介导的信号通路调控：在 TGF-β 信号通路中，DAB2 支持受体内吞作用，并促进 SMAD2 和 TGF-β 激活激酶 1 的磷酸化和激活，进而促进 JNK 激活和纤连蛋白合成；在Wnt信号通路中，DAB2通过与axin结合稳定β-catenin破坏复合物，并螯合LRP6以促进网格蛋白介导的内吞作用，从而抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路，同时促进非经典分支的激活。DAB2还通过结合GRB2并与SOS1竞争来调节生长因子和Ras信号通路，从而降低GRB2-SOS1的偶联并减弱ERK的激活；此外，DAB2还通过与SRC相互作用来抑制其激活磷酸化，从而减弱SRC依赖性通路，并影响雄激素受体信号通路，其中对SRC结合的竞争会改变AR的输出。在免疫调节中，DAB2作为TLR4内吞作用和信号传导的负调控因子，参与CSF-1依赖性巨噬细胞通路，从而影响先天免疫反应、巨噬细胞黏附和扩散以及更广泛的炎症信号通路。 |
| 参考文献 |
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