DAG Lipase α Antibody (Rabbit mAb) [D2E6]
目录号: F8229
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Mouse cerebellum
操作要点
WB
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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115 kDa
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| 阳性对照 | Mouse brain; Mouse Cerebellum; Rat brain; Human cortex; Human cerebellum |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| DAG Lipase α Antibody (Rabbit mAb) [D2E6] 可检测内源性 DAG Lipase α 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，内体，内膜系统，突触后膜，突触 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9Y4D2 |
| 克隆号 |
|---|
| D2E6 |
| 别名 |
|---|
| C11orf11; DAGL-alpha; DAGL(ALPHA); DAGLA; DAGLALPHA; DGL-alpha; DGLA; KIAA0659; Neural stem cell-derived dendrite regulator; NSDDR; Sn1-specific diacylglycerol lipase alpha |
| 背景 |
|---|
| DAG 脂肪酶 α 是二酰甘油脂肪酶家族的跨膜丝氨酸水解酶，是中枢神经系统中内源性大麻素 2-花生四烯酸甘油酯 (2-AG) 的主要生物合成酶，以钙依赖的方式将 sn-1-酰基二酰甘油转化为 2-单酰甘油和游离脂肪酸，从而将膜磷脂周转与大麻素受体信号传导联系起来。该蛋白具有一个短的N端胞质区段，其后是四个紧密排列的跨膜螺旋和一个大的C端胞质催化结构域，该结构域呈α/β水解酶折叠，具有疏水性活性位点，其中包含高度保守的Ser-Asp-His催化三联体，以及位于β折叠7和8之间的调节环，该调节环起到控制活性位点入口的盖子作用，并带有多个与活性调节相关的磷酸化位点。DAG脂肪酶α选择性水解二酰甘油sn-1位的酯键，生成2-单酰甘油类物质，例如2-AG；机制研究描述了一个两步酰基酶过程，其中组氨酸活化的丝氨酸攻击酰基羰基形成四面体中间体和单酰甘油产物，随后酰基酶发生水介导的水解，释放游离脂肪酸并再生催化丝氨酸。在神经回路中，DAG脂肪酶α富集于突触后胞体树突膜和突触周围棘区，在那里它将Gq连接的受体激活和去极化与按需2-AG合成偶联，用于逆行信号传导；纹状体中型棘状神经元的精确亚细胞定位显示，DAG脂肪酶α与mGluR5在突触周围区域共分布，DAGLα依赖的2-AG通过激活GABA能和谷氨酸能神经末梢上的突触前CB1受体，介导去极化诱导的抑制和兴奋抑制。DAG脂肪酶α的基因操作证实了其在中枢神经系统内源性大麻素信号传导中的核心作用：DAGLα敲除小鼠缺乏跨突触2-AG信号传导，表现出突触传递的逆行抑制受损，以及轴突生长、突触可塑性和成年神经发生改变，这表明DAGLα产生的2-AG在发育过程中的神经回路连接和持续的神经回路调节中是必需的。除了突触调节外，DAG 脂肪酶 α 衍生的 2-AG 及其下游代谢物（包括花生四烯酸和前列腺素）参与神经炎症和神经保护；抑制或删除 DAGLα 可减少神经炎症反应，并且在神经退行性疾病模型中与神经保护作用相关，但广泛阻断 DAGLα 也会破坏神经可塑性并改变脑脂质组成，导致焦虑、抑郁、癫痫发作和其他神经精神症状增加，这表明 DAGLα 是中枢神经系统脂质信号传导中一个可调控但又敏感的节点。对 DAGLα 敲除小鼠的系统研究揭示了更广泛的代谢作用：这些动物体型偏瘦，食物摄入量和体重均有所下降，空腹胰岛素、甘油三酯和总胆固醇水平也较低，这表明 DAGLα 依赖的 2-AG 有助于食欲调节和代谢稳态，而抑制 DAGLα 可能为治疗肥胖症和代谢综合征提供途径，同时还可以通过 CB1 连接通路影响胃肠道动力。 |
| 参考文献 |
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