DAG Lipase β Antibody [K18L4]

目录号: F6053

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: MCF7, Lane 2: THP-1, Lane 3: RAW, Lane 4: Neuro-2a

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50 CHIP1:50

抗体应用
WB, IP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
70 kDa

阳性对照	MCF7 cells; THP-1 cells; Raw 264.7 cells; Neuro-2a cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
DAG Lipase β Antibody [K18L4] 可检测内源性 DAG Lipase β 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，内膜系统

Uniprot ID
Q8NCG7

克隆号
K18L4

别名
Sn-1-specific diacylglycerol lipase beta; DAGLB

背景
二酰甘油脂肪酶β (DAGLβ) 是两种密切相关的丝氨酸水解酶同工酶之一，它们在sn-1位水解二酰甘油 (DAG) 生成2-花生四烯酸甘油酯 (2-AG)，后者是内源性大麻素受体CB1和CB2的主要配体。DAGLβ是一种膜相关蛋白，具有多个跨膜结构域和一个包含催化三联体的大型C端胞质区。这种结构使其定位于细胞内膜和富含脂质的区室，从而能够利用磷脂酶偶联受体信号传导下游产生的DAG。 DAGLβ优先在单核吞噬细胞系统和其他免疫相关细胞类型中表达，它能将含花生四烯酸的DAG转化为2-AG和游离花生四烯酸，从而促进内源性大麻素信号传导和下游类花生酸的生成，进而调节炎症和伤害性感受通路。DAGLβ衍生的2-AG和花生四烯酸参与巨噬细胞介导的炎症、LPS诱导的痛觉过敏以及肝内胆管癌等癌症中的促肿瘤信号传导。在肝内胆管癌中，DAGLβ的上调与转移相关，并与AP-1驱动的转录回路和炎症正反馈环路相关。在模型系统中，DAGLβ的药理学或基因抑制可降低局部2-AG和类花生酸水平，抑制促炎细胞因子的释放，并逆转炎症和神经性疼痛表型。 DAGLα 是突触 2-AG 的主要亚型，但 DAGLβ 也对细胞类型特异性环境中的神经元和小胶质细胞 2-AG 池有所贡献，其活性受到 Ca²⁺ 依赖性信号传导、受体偶联 DAG 生成和翻译后修饰的严格调控。

背景

二酰甘油脂肪酶β (DAGLβ) 是两种密切相关的丝氨酸水解酶同工酶之一，它们在sn-1位水解二酰甘油 (DAG) 生成2-花生四烯酸甘油酯 (2-AG)，后者是内源性大麻素受体CB1和CB2的主要配体。DAGLβ是一种膜相关蛋白，具有多个跨膜结构域和一个包含催化三联体的大型C端胞质区。这种结构使其定位于细胞内膜和富含脂质的区室，从而能够利用磷脂酶偶联受体信号传导下游产生的DAG。 DAGLβ优先在单核吞噬细胞系统和其他免疫相关细胞类型中表达，它能将含花生四烯酸的DAG转化为2-AG和游离花生四烯酸，从而促进内源性大麻素信号传导和下游类花生酸的生成，进而调节炎症和伤害性感受通路。DAGLβ衍生的2-AG和花生四烯酸参与巨噬细胞介导的炎症、LPS诱导的痛觉过敏以及肝内胆管癌等癌症中的促肿瘤信号传导。在肝内胆管癌中，DAGLβ的上调与转移相关，并与AP-1驱动的转录回路和炎症正反馈环路相关。在模型系统中，DAGLβ的药理学或基因抑制可降低局部2-AG和类花生酸水平，抑制促炎细胞因子的释放，并逆转炎症和神经性疼痛表型。 DAGLα 是突触 2-AG 的主要亚型，但 DAGLβ 也对细胞类型特异性环境中的神经元和小胶质细胞 2-AG 池有所贡献，其活性受到 Ca²⁺ 依赖性信号传导、受体偶联 DAG 生成和翻译后修饰的严格调控。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28901776/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37366545/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%