Decorin Antibody (Rabbit mAb) [E13A13]
目录号: F8203
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Mouse uterus
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, FCM |
| 反应性 |
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| Mouse, Rat, Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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40 kDa
90-140 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse uterus tissue; Human colon tissue; Rat uterus tissue; Human pancreas tissue; Mouse colon tissue; Human esophagus tissue; Rat colon tissue; Human bladder cancer tissue; Human uterus tissue; Human liver tissue; Human placenta tissue; MG-63 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-1080 cells |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| Decorin Antibody (Rabbit mAb) [E13A13] 可检测内源性 Decorin 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞外基质，细胞外环境 |
| Uniprot ID |
|---|
| P07585 |
| 克隆号 |
|---|
| E13A13 |
| 别名 |
|---|
| SLRR1B, DCN, Decorin, Bone proteoglycan II, PG-S2, PG40 |
| 背景 |
|---|
| Decorin是一种基质来源的富含亮氨酸的小型蛋白聚糖，它修饰细胞外基质中的胶原纤维，并作为结构和信号枢纽，控制纤维形成、受体活性和组织稳态。其蛋白核心呈弯曲的螺线管状结构，由串联的富含亮氨酸的重复序列构成，具有N端糖胺聚糖连接位点和二聚化界面，使其凹面能够结合纤维状胶原和纤维蛋白，凸面能够与生长因子和受体胞外结构域结合。与I型胶原和其他纤维状胶原的相互作用调节纤维的横向组装和间距，改变肌腱、皮肤和软骨等组织中纤维的直径、排列和力学性质，从而影响基质刚度和承载能力。直接与纤维蛋白原的D区结合，使其在血凝块形成中发挥结构作用。核心蛋白聚糖（decorin）掺入纤维蛋白网络可减小纤维直径，产生更细、更弯曲的纤维蛋白纤维，并加速组织型纤溶酶原激活剂（tPA）依赖性纤溶，表明核心蛋白聚糖在止血和伤口修复过程中影响纤维蛋白的组装和清除。作为一种可溶性基质成分，核心蛋白聚糖通过与多种受体酪氨酸激酶（RTK）结合发挥作用，包括表皮生长因子受体（EGFR）、人表皮生长因子受体2（HER2）、Met、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、胰岛素样生长因子受体（IGF-IR）和某些Toll样受体，从而抑制多种RTK，引发短暂的受体激活，随后抑制下游信号通路，例如ERK、PI3K/AKT和β-catenin，并促进受体内化和溶酶体降解。与Met的结合可降低β-catenin信号传导并抑制细胞生长，而与VEGFR2的相互作用则可抑制血管生成信号传导并触发持续的内皮细胞自噬，从而将核心蛋白聚糖与肿瘤抑制和抗血管生成机制联系起来。在癌症模型中，肿瘤基质中装饰蛋白的表达或外源性装饰蛋白的给药可通过协同抑制受体酪氨酸激酶（RTK）和调节转化生长因子-β（TGF-β）活性来降低肿瘤生长、限制侵袭并抑制新生血管形成，从而确立了装饰蛋白作为一种强效细胞外抑癌因子的地位。装饰蛋白还通过控制PDCD4及其相关介质以及塑造细胞因子和趋化因子的表达来调节炎症和免疫通路，将其基于基质的信号传导与免疫监视和肿瘤-炎症相互作用联系起来。在软骨中，装饰蛋白通过增加聚集蛋白聚糖分子之间以及聚集蛋白聚糖与II型胶原纤维之间的粘附力来稳定聚集蛋白聚糖网络，促进聚集蛋白聚糖在新合成基质中的保留，并支持正常关节生物力学所需的压缩模量、水力渗透性和能量耗散特性。 Decorin富含亮氨酸重复结构、胶原蛋白和纤维蛋白结合能力以及广泛的受体相互作用能力，使其兼具作为纤维形成结构调节剂和生长因子及RTK信号传导可溶性调节剂的双重作用，使其成为研究细胞外基质生物学、组织修复和基质驱动的肿瘤进展控制的机制丰富的靶点。 |
| 参考文献 |
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