DMT1/SLC11A2 Antibody (Mouse mAb) [G3J24]
目录号: F0991
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: A549, Lane 2: A549 (KO DMT1)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, FCM |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 抗体类型 |
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| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
实际分子量
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62 kDa
80 kDa
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| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Mouse duodenum tissue; Human endometrium cancer tissue; SH-SY5Y cells; A549 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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| DMT1/SLC11A2 Antibody (Mouse mAb) [G3J24] 可检测内源性 DMT1/SLC11A2 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
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| 细胞膜，内体，高尔基体 |
| Uniprot ID |
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| P49281 |
| 克隆号 |
|---|
| G3J24 |
| 别名 |
|---|
| DCT1, DMT1, NRAMP2, OK/SW-cl.20, SLC11A2, Natural resistance-associated macrophage protein 2, NRAMP 2, Divalent cation transporter 1, Divalent metal transporter 1, Solute carrier family 11 member 2, DMT-1 |
| 背景 |
|---|
| 二价金属转运蛋白1（DMT1，又称SLC11A2、NRAMP2或DCT1）是一种质子偶联的二价阳离子转运蛋白，是十二指肠肠细胞顶端膜上亚铁离子摄取的主要跨膜途径，也是多种细胞类型中转铁蛋白内体中铁离子输出的主要途径，因此在非血红素铁的获取和细胞铁代谢中发挥着核心作用。该蛋白是一种多通道膜转运蛋白，具有12个预测的跨膜螺旋结构以及胞质N端和C端。选择性剪接和铁反应元件的差异性使用产生了具有不同亚细胞定位和转录后调控的亚型，使得DMT1能够在组织特异性模式下于质膜和内体膜上发挥作用。转运活性将质子内流与二价金属的摄取偶联起来，对Fe²⁺具有最高的偏好性，其最适pH值在弱酸性范围内，与十二指肠腔和内体隔室的pH值相匹配。DMT1也能以较低的选择性转运Mn²⁺和其他第一过渡系金属，从而为营养必需金属和潜在毒性金属提供了一条共同的转运途径。在肠刷状缘，铁还原酶和膳食还原剂将肠腔中的Fe³⁺转化为Fe²⁺，然后DMT1将其转运至肠细胞。而在红系前体细胞和其他细胞的转铁蛋白循环内体中，DMT1介导转铁蛋白结合的铁被还原后，Fe²⁺从内体释放到胞质溶胶中，为血红素合成、铁硫簇组装和铁储存提供铁。 DMT1的表达通过依赖于铁反应元件（IRE）和不依赖于IRE的机制响应细胞内铁状态，并受系统性铁代谢调节因子的调控，从而使转运蛋白的丰度与机体铁需求相匹配，并将DMT1整合到铁稳态的铁调素-铁转运蛋白轴中。DMT1也存在于脑微血管内皮细胞、神经元和胶质细胞中，参与铁跨越血脑屏障的转运、神经元对铁的摄取以及锰的转运，从而将DMT1功能、局部脑铁负荷以及多巴胺能神经元和其他神经元群体在衰老和神经退行性疾病中对氧化应激的易感性联系起来。啮齿动物中DMT1基因的突变或功能缺失会导致低色素性小细胞性贫血，并伴有肠道铁吸收障碍和红系细胞铁利用缺陷。而已知的人类DMT1功能缺失突变则会导致严重的贫血，并伴有红系细胞铁处理的异常，这凸显了DMT1介导的亚铁离子转运对于膳食铁吸收和红细胞生成的重要性。相反，DMT1表达或活性的增加与特定组织中的铁过载以及实验模型中脑内铁和锰含量的升高相关。在这些模型中，过量的金属积累会导致线粒体功能障碍、活性氧的产生和神经退行性改变。DMT1已被证实是帕金森病和其他神经退行性疾病中观察到的铁锰失衡的促成因素之一。 |
| 参考文献 |
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