Dnmt3L Antibody (Rabbit mAb) [N11C3]
目录号: F8298
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: F9, Lane 2: NCCIT
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Mouse, Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
预测分子量
实际分子量
|
|---|
|
44 kDa
44 kDa
|
| *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？ 以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。 |
| 阳性对照 | Human yolk sac tumor tissue; Human kidney tissue; Human liver tissue; Human seminoma tissue; NCCIT cells; F9 cells; mESC cells |
|---|---|
| 阴性对照 | Rat testis tissue; HeLa cells; T-47D cells; NTERA-2 cl.D1 (NT2/D1) cells |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
|
| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
|
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
| Dnmt3L Antibody (Rabbit mAb) [N11C3] 可检测内源性 Dnmt3L 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UJW3 |
| 克隆号 |
|---|
| N11C3 |
| 别名 |
|---|
| DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3-like, DNMT3L |
| 背景 |
|---|
| DNMT3L（DNA甲基转移酶3样蛋白）是DNMT3家族中催化活性缺失的成员，它作为从头甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B的调节辅助因子，整合组蛋白H3尾部状态和Polycomb蛋白的占位情况，从而调控生殖细胞和胚胎干细胞中的DNA甲基化模式。DNMT3L包含一个富含半胱氨酸的N端结构域，该结构域可结合组蛋白H3的N端；以及一个C端甲基转移酶样结构域，该结构域可与DNMT3A和DNMT3B的催化C端结构域相互作用，形成复合物。在复合物中，DNMT3L可加速DNA和S-腺苷-L-蛋氨酸的结合，并刺激甲基转移酶活性，而自身并不修饰胞嘧啶。 DNMT3L 可将 DNMT3A 和 DNMT3B 的催化活性提高 1.5-15 倍，通过其自身的 C 端直接结合它们的催化结构域，降低 DNA 和 AdoMet 的 Km 值，并作为瞬时“底物交换因子”打开活性位点以促进底物结合，然后在 DNA 结合后解离，使 DNMT3A 或 DNMT3B 处于闭合构象，缓慢释放 DNA，有利于进行性甲基化。 DNMT3L还能读取组蛋白H3第4位赖氨酸的甲基化状态：它特异性地结合于第4位赖氨酸未甲基化的H3尾部（H3K4me0），而这种相互作用会被H3K4甲基化强烈抑制。因此，DNMT3L与H3的结合能够识别缺乏活性H3K4标记的染色质区域，并将其与DNMT3A2的募集或激活偶联，从而启动从头DNA甲基化。这种机制是生殖细胞中甲基化印记建立和逆转录转座子沉默的基础。DNMT3L主要与DNMT3A2、DNMT3B和核心组蛋白结合，这支持了这样一种模型：DNMT3L位于核小体H3K4me0位点，并成核形成包含DNMT3A/3B的复合物，这些复合物在配子发生过程中将甲基化引入印记基因座和转座元件中富含CpG的DNA上。在胚胎干细胞中，DNMT3L 发挥双重作用：它作为管家基因基因体 DNA 甲基化的正调控因子，与 DNMT3A 和 DNMT3B 共同促进组成型表达位点的甲基化；同时，它作为 H3K4me3/H3K27me3 标记的双价发育基因启动子甲基化的负调控因子。在这些双价启动子处，DNMT3L 与 PRC2 组分 EZH2 相互作用，并通过与 DNMT3A/3B 竞争结合 PRC2/H3K27me3 区域，帮助维持启动子低甲基化状态，从而保持低甲基化、Polycomb 抑制但具有激活能力的基因表达状态；当 DNMT3L 水平降低时，双价启动子发生高甲基化，发育基因表达程序受到干扰。 DNMT3L对于胚胎干细胞分化为原始生殖细胞也至关重要，它通过抑制同源异型基因RHOX5启动子区域的DNA甲基化，激活RHOX5的转录，从而支持生殖细胞的特化。这凸显了DNMT3L在不同基因组靶点上作为甲基化促进因子和拮抗因子的双重作用具有情境依赖性。DNMT3L表达的调控进一步将其与甲基化机制联系起来：在胚胎发育过程中，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L自身都会对其启动子进行甲基化，形成一个自调控回路。在该回路中，如ICF综合征模型所示，DNMT3B的缺陷会导致DNMT3L启动子低甲基化、DNMT3L转录增加以及甲基化平衡紊乱，进而影响基因印记和基因组稳定性。甲基转移酶样 C 端结构、H3K4me0 敏感的组蛋白结合域、直接激活 DNMT3A/3B 催化、与二价启动子处的 PRC2 相互作用，以及在印记建立、逆转录转座子沉默、管家基因甲基化和生殖细胞分化中的作用，使得 DNMT3L 成为理解染色质信号和 DNMT3 酶如何协同作用以在发育、疾病和相关免疫病理中塑造新的 DNA 甲基化模式的机制中心调节因子。 |
| 参考文献 |
|---|
|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
