HuC + HuD Antibody (Mouse mAb) [M16B6]
目录号: F0029
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: Mouse brain, Lane 3: Rat brain
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:200
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比: 1:200
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, IF |
| 反应性 |
|---|
| Avian, Chicken, Human, Zebrafish |
| 抗体类型 |
|---|
| Mouse Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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40 kDa
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| 阳性对照 | Rat primary cortical neurons; Differentiated neurons from H9 ESC-derived NSCs; Cultured axolotl sensory neurons |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:200），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
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实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
HuC + HuD Antibody (Mouse mAb) [M16B6] 可检测内源性 HuC 和 HuD 总蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q14576 |
| 克隆号 |
|---|
| M16B6 |
| 别名 |
|---|
| ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 3 (Hu antigen C); elrc; elrd; HUC; HUCL; HUD; id:ibd1248; PLE21; PNEM; wu:fb77b03; wu:fc24h01; zHuC |
| 背景 |
|---|
HuC 和 HuD 是 ELAV/ELAVL RNA 结合蛋白家族中神经元特异性成员，它们识别靶转录本中富含 U 和 AU 的元件，并调控参与神经元分化、突触活动和应激反应的转录后基因表达程序。这两种蛋白都具有保守的模块化结构，包含三个由柔性铰链区分隔的 RNA 识别基序；对 HuC 的功能分析表明，所有三个 RRM 以及铰链区对于结合调控性 RNA 元件和控制神经元前体 mRNA 的选择性剪接都是必需的，这表明完整的 RNA 结合界面及其构象柔性参与了剪接位点的选择。HuD 结合生长和可塑性相关 mRNA 的 3′ UTR 区，并提高其稳定性和翻译效率，已验证的靶标包括 APP 和 BACE1 mRNA 以及长链非编码 RNA BACE1AS（后者本身可以稳定 BACE1 mRNA）。与这些转录本的协同结合可提高APP和BACE1的表达，并促进APP加工，从而增加Aβ的产生。HuD还与更广泛的编码和非编码RNA结合，这些RNA与神经元信号传导、学习和记忆相关，并调节mRNA的半衰期和剪接，因此其表达水平会影响人类神经元中多种阿尔茨海默病相关蛋白和突触调节因子的丰度。在促神经转录因子的控制下，HuD的表达沿神经元谱系增加，并在成熟神经元中保持高水平。在人iPSC衍生神经元中调控HuD水平会改变整体翻译模式和树突棘特征，这与HuD在塑造神经元蛋白质组中的作用相一致。在神经母细胞瘤和其他具有神经元特征的肿瘤中，HuD过表达，并结合编码mTORC1信号调节因子的mRNA，特别是GRB10和内质网驻留蛋白ARL6IP1。 HuD依赖性地稳定这些靶点可降低mTORC1活性，增强自噬，并减弱应激条件下的细胞凋亡，这些条件有利于肿瘤细胞存活。HuD表达降低的神经母细胞瘤异种移植模型显示肿瘤生长减缓，表明其RNA结合活性与癌细胞活力相关。由于这些蛋白具有严格的神经元谱系特异性，强烈的HuC/D免疫反应性被广泛用作神经母细胞瘤和神经内分泌肿瘤的诊断标志物。HuC和HuD作为神经元特异性RNA调控子的核心组成部分，通过其RNA调节结构域（RRM）整合序列特异性结合，并调控mRNA的稳定性、剪接和翻译，从而参与调控神经发育、突触维持和应激条件下细胞存活的通路。 |
| 参考文献 |
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