Na+/H+ Exchanger-1 Antibody [K9D3]

目录号: F4375

抗体应用：反应性：Mouse, Human, Amphibian, Fish, Avian, Vertebrates

Lane 1: U87MG, Lane 2: THP-1, Lane 3: 22RV1, Lane 4: Mouse brain

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:500

抗体应用
WB

反应性
Mouse, Human, Amphibian, Fish, Avian, Vertebrates

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
~100-110 kDa

阳性对照	Human kidney
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Na+/H+ Exchanger-1 Antibody [K9D3] 可检测内源性 Na+/H+ Exchanger-1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，内膜系统

Uniprot ID
P19634

克隆号
K9D3

别名
Sodium/hydrogen exchanger 1; APNH; Na(+)/H(+) antiporter, amiloride-sensitive; Na(+)/H(+) exchanger 1 (NHE-1); Solute carrier family 9 member 1; SLC9A1; APNH1; NHE1

背景
钠/氢交换蛋白1 (NHE1，SLC9A1) 是一种普遍表达的整合膜反向转运蛋白，在调节细胞内pH (pHi) 稳态中发挥着核心作用。NHE1由12个跨膜螺旋(TMH)组成，其N端和C端均面向胞质。关键的转运区段包括TM IV、VII和IX，以及重入环IL2和IL4，胞外环5 (EL5) 上的糖基化位点赋予其结构稳定性。延伸的约315个氨基酸残基的C端胞质结构域包含多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点和ezrin结合基序（氨基酸残基553-564），这些基序将NHE1锚定到肌动蛋白细胞骨架上。 NHE1 受细胞内酸化变构激活，促进质子与非转运修饰位点（Hill 系数约为 3）结合，通过螺旋倾斜和充满水的通道触发构象变化，从内向构象转变为外向构象，类似于细菌 NhaA 转运蛋白。它以 1:1 的化学计量比介导细胞外 Na+（Km 5–50 mM）与细胞内 H+ 的电化学交换，利用跨膜 Na+ 梯度作为驱动力，无需直接能量输入。这使得细胞内 pH 值在酸中毒后能够快速恢复，通过 Na+ 内流调节细胞体积，并通过 ERM-肌动蛋白相互作用支撑伪足的突出。激素和生长因子信号可通过 NHERF1、ERK 和 PKA 通路磷酸化 C 端丝氨酸残基（例如 S703、Thr653），使 pH 值设定点向碱性方向移动。病理上，在缺血再灌注损伤中，酸激活的NHE1通过反向NCX活性促进细胞毒性Na+/Ca2+超载，加剧心肌梗死。慢性NHE1上调还与通过细胞周围碱化和基质重塑促进肿瘤侵袭以及心脏肥大有关。

背景

钠/氢交换蛋白1 (NHE1，SLC9A1) 是一种普遍表达的整合膜反向转运蛋白，在调节细胞内pH (pHi) 稳态中发挥着核心作用。NHE1由12个跨膜螺旋(TMH)组成，其N端和C端均面向胞质。关键的转运区段包括TM IV、VII和IX，以及重入环IL2和IL4，胞外环5 (EL5) 上的糖基化位点赋予其结构稳定性。延伸的约315个氨基酸残基的C端胞质结构域包含多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点和ezrin结合基序（氨基酸残基553-564），这些基序将NHE1锚定到肌动蛋白细胞骨架上。 NHE1 受细胞内酸化变构激活，促进质子与非转运修饰位点（Hill 系数约为 3）结合，通过螺旋倾斜和充满水的通道触发构象变化，从内向构象转变为外向构象，类似于细菌 NhaA 转运蛋白。它以 1:1 的化学计量比介导细胞外 Na+（Km 5–50 mM）与细胞内 H+ 的电化学交换，利用跨膜 Na+ 梯度作为驱动力，无需直接能量输入。这使得细胞内 pH 值在酸中毒后能够快速恢复，通过 Na+ 内流调节细胞体积，并通过 ERM-肌动蛋白相互作用支撑伪足的突出。激素和生长因子信号可通过 NHERF1、ERK 和 PKA 通路磷酸化 C 端丝氨酸残基（例如 S703、Thr653），使 pH 值设定点向碱性方向移动。病理上，在缺血再灌注损伤中，酸激活的NHE1通过反向NCX活性促进细胞毒性Na+/Ca2+超载，加剧心肌梗死。慢性NHE1上调还与通过细胞周围碱化和基质重塑促进肿瘤侵袭以及心脏肥大有关。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34108458/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33273619/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%