SirT4 Antibody [C24N9]
目录号: F7735
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: Neuro-2a, Lane 2: C2C12, Lane 3: RAW264.7, Lane 4: NIH/3T3
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
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| Mouse |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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32 kDa
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| 阳性对照 | Hepa 1-6 cells; Neuro-2a cells; C2C12 cells; RAW 264.7 cells; NIH/3T3 cells |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| SirT4 Antibody [C24N9] 可检测内源性 SirT4 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 线粒体 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q8R216 |
| 克隆号 |
|---|
| C24N9 |
| 别名 |
|---|
| NAD-dependent protein lipoamidase sirtuin-4, mitochondrial; SIR2-like protein 4; Sirtuin 4; SIRT4 |
| 背景 |
|---|
| SIRT4 属于 sirtuin 家族的 NAD+ 依赖性酶，主要定位于线粒体，在那里它发挥着不同于经典脱乙酰酶功能的代谢调控作用。SIRT4 采用保守的催化核心，其灵活的活性位点几何结构使其能够容纳多种底物，从而实现脱酰基、ADP-核糖基化和脂酰胺酶活性，以及选择性脱乙酰作用。其酶促作用靶向丙二酰辅酶A脱羧酶，通过在特定赖氨酸残基上进行脱乙酰化，抑制丙二酰辅酶A转化为乙酰辅酶A，从而维持丙二酰辅酶A的水平。在营养充足的状态下，丙二酰辅酶A通过变构抑制肉碱棕榈酰转移酶-1，从而减少脂肪酸氧化，同时促进脂肪生成。 SIRT4 通过 ADP 核糖基化进一步修饰谷氨酰胺脱氢酶，限制谷氨酰胺分解和三羧酸循环的补充代谢，从而维持线粒体氧化还原平衡，并限制基因毒性应激反应中的增殖信号。SIRT4 与丙酮酸脱氢酶复合物相互作用，通过 E2 亚基二氢硫辛酰赖氨酸乙酰转移酶的去脂酰胺化作用，破坏丙酮酸脱氢酶的通量，并在能量危机期间将碳重新定向至氧化磷酸化或抗氧化防御。SIRT4 通过抑制分解代谢转变来协调骨骼肌和脂肪组织中的脂质稳态；而在肿瘤细胞中，它通过限制谷氨酰胺将 DNA 损伤感知与代谢停滞偶联，激活 AMPK-p53 磷酸化级联反应，从而诱导自噬并抑制 Warburg 重编程。 SIRT4 活性降低伴随着胰腺癌、前列腺癌和结直肠癌的肿瘤发生加速，其中不受控制的 MCD 激活和谷氨酰胺通量促进生物质积累和转移扩散。 |
| 参考文献 |
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