Mouse Naive CD4+ T Negative Selection Kit

 

1. 样本准备:
a. 制备单细胞悬液：在 70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的 PBS 冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于 50 ml 离心管中，500 g，离心 5 min。
b. 离心完成后，弃上清，加入5 ml ACK 红细胞裂解液，室温裂解 5 min，再加入 20 ml PBS，500 g，离心 5 min。
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。
c. 离心完成后，弃上清，将脾细胞重悬于 PBS，细胞悬液用 70 μm 细胞筛网过滤后，计数。计数完成后，继续以 500 g，离心 5 min。
d. 离心完成后，弃上清，将细胞重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为 1×10⁸ cells/ml。
2. 将 100 μl 细胞悬液（1×10⁷ 个细胞）加入无菌流式管底部，再加入2 μl Biotin-Ab Mix，混匀后 4℃ 孵育 10 min。
注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架特点也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Ab Mix 用量。
3. 孵育完成后，在流式管中加入 20 μl 链霉亲和素磁珠（使用前涡旋振荡重悬磁珠），混匀后 4℃ 孵育 10 min。孵育过程中应轻轻敲打管壁 1~2 次，防止细胞和磁珠沉降。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加链霉亲和素磁珠用量。例如分选 5×10⁷ 细胞，则应在 500 μl 细胞悬液中加入 10 μl Biotin-Ab Mix 和 100 μl 链霉亲和素磁珠。如果分选少于 1×10⁷ 个细胞，则将细胞悬液体积补至 100 μl，使用 2 μl Biotin-Ab Mix 和 20 μl 链霉亲和素磁珠。
4. 孵育完成后，在流式管加入 2.5 ml 分选 buffer，以移液器上下混合吹打 5 次混匀（避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀）。
5. 将含有细胞的分选流式管置于磁力架上（若没有合适的磁力架，可将流式管中液体转移到 15 mL 离心管中再置于磁力架上），静置5 min。
6. 将细胞悬液倒入无菌离心管中（倾倒过程中流式管不要脱离磁力架）或用吸管吸入离心管中（勿将液体吸尽，防止吸到磁珠），500 g，离心5 min。细胞悬液中即包含纯化的小鼠初始CD4+ T细胞，离心后弃上清，收集细胞。
7. 根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。