Anti-c-Fos Rabbit Antibody [M9L15]

目录号: F0267

本抗体识别c-Fos蛋白，WB检测中对部分细胞系需经血清饥饿处理并用TPA刺激以增强c-Fos表达。

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: HeLa (serum-starved overnight; TPA,4 hours)
Lane 2: HeLa (serum-starved overnight)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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客户使用该产品的实验数据

操作要点

WB
Hela等特定细胞系中c-Fos的内源性水平比较低，建议添加诱导刺激（如过夜血清饥饿处理后，TPA再处理4小时）使得c-Fos维持较高内源性水平。
刺激后c-Fos的表达迅速且短暂，建议刺激完成后立即收样以防止蛋白降解。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 FCM1:1600 - 1:6400 CHIP1:50

抗体应用
WB, FCM, ChIP

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
62 kDa

阳性对照	mouse cerebral cortex; mouse pons; Hela (serum-starved overnight + 400nM TPA-stimulated, 4 h); H-4-II-E (serum-starved overnight + 400nM TPA-stimulated, 4 h); NIH/3T3 (serum-starved overnight + 400nM TPA-stimulated, 4 h); PC-12 (serum-starved overnight, treated with h-βNGF, 50ng/ml, 2h)
阴性对照	Hela; H-4-II-E; NIH/3T3; PC-12

样品处理数据示例

样品	处理情况
Hela	Serum-starvation (overnight) + TPA (400nM, 4 h)
H-4-II-E	Serum-starvation (overnight) + TPA (400nM, 4 h)
NIH/3T3	Serum-starvation (overnight) + TPA (400nM, 4 h)
NIH/3T3	Serum-starvation (overnight) + TPA (400nM, 4 h) + λ-phosphatase
PC-12	Serum-starvation (overnight) + h-βNGF (50ng/mL, 2h)
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^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-c-Fos Rabbit Antibody [M9L15] 可检测内源性总 c-Fos 的蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，内质网，细胞核

Uniprot ID
P01100

克隆号
M9L15

背景
Fos 家族核癌基因包括 c-Fos、FosB、Fos 相关抗原 1 (FRA1) 和 Fos 相关抗原 2 (FRA2)。与以单一异构体形式存在的其他 Fos 蛋白不同，FosB 有两种变体：全长 FosB 和称为 FosB2 (Delta FosB) 的截短版本，后者缺少羧基末端的 101 个氨基酸。Fos 蛋白在响应各种细胞外信号（如生长因子、细胞因子、神经递质、多肽激素和应激）时会快速且短暂地表达。这些蛋白质与 Jun 家族成员 (c-Jun、JunB 和 JunD) 二聚化形成转录因子激活蛋白-1 (AP-1)，该蛋白与 DNA 中的 TRE/AP-1 元素结合以调控基因转录。Fos 和 Jun 蛋白具有二聚化所必需的亮氨酸拉链基序和促进 DNA 结合的碱性结构域。不同的 Fos/Jun 异二聚体具有不同的激活 AP-1 依赖性基因的能力。除了表达水平之外，Erk 激酶对 Fos 蛋白的磷酸化可增强其转录活性，以响应外部刺激。具体而言，Erk5 对 c-Fos 在 Ser32 和 Thr232 处的磷酸化可增加其稳定性和核定位。c-Fos、FosB 或 FRA2 的异常表达可导致细胞的肿瘤转化。

背景

Fos 家族核癌基因包括 c-Fos、FosB、Fos 相关抗原 1 (FRA1) 和 Fos 相关抗原 2 (FRA2)。与以单一异构体形式存在的其他 Fos 蛋白不同，FosB 有两种变体：全长 FosB 和称为 FosB2 (Delta FosB) 的截短版本，后者缺少羧基末端的 101 个氨基酸。Fos 蛋白在响应各种细胞外信号（如生长因子、细胞因子、神经递质、多肽激素和应激）时会快速且短暂地表达。这些蛋白质与 Jun 家族成员 (c-Jun、JunB 和 JunD) 二聚化形成转录因子激活蛋白-1 (AP-1)，该蛋白与 DNA 中的 TRE/AP-1 元素结合以调控基因转录。Fos 和 Jun 蛋白具有二聚化所必需的亮氨酸拉链基序和促进 DNA 结合的碱性结构域。不同的 Fos/Jun 异二聚体具有不同的激活 AP-1 依赖性基因的能力。除了表达水平之外，Erk 激酶对 Fos 蛋白的磷酸化可增强其转录活性，以响应外部刺激。具体而言，Erk5 对 c-Fos 在 Ser32 和 Thr232 处的磷酸化可增加其稳定性和核定位。c-Fos、FosB 或 FRA2 的异常表达可导致细胞的肿瘤转化。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10963134/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17018293/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%