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Anti-CD68 Rabbit Antibody [M20C19]

目录号: F3794

    抗体应用： 反应性：
    规格 价格 库存 购买数量
    20uL 790 现货
    50uL 1240 现货
    100uL 1990 现货
    100uL*2 3790 现货

    400-668-6834

    info@selleck.cn

    操作要点

    WB
    湿转参考条件：200 mA, 60 min。

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    1:100
    1:50
    1:500
    抗体应用
    WB, IHC, IF, FCM
    反应性
    Mouse, Rat
    抗体类型
    Rabbit
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
    储存条件(自收到货起)
    -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    实际分子量
    37 kDa
    100 kDa
    *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？
    以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。
    阳性对照 Mouse spleen; Mouse colon; Mouse large B cell lymphoma; Rat spleen; Rat lung; Rat liver; Kupffer cells of rat liver; Bone Marrow Cell-derived Macrophages (BMDM); J774A.1; RAW 264.7
    阴性对照 Mouse skeletal muscle tissue; RAW264.7 (treated with PNGase F); Mouse spleen (treated with PNGase F)

    实验方法

    WB
    实验步骤：
     
    样品制备
    1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
    2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
    6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
     
    转膜
    1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
    （注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
     
    封闭
    1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
    2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
    3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
    2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
    3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
    4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
    2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
     
    IF
    实验步骤：
     
    标本制备
    1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
    注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
    2. 室温固定细胞 15 分钟。
    3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色。
     
    免疫染色
    1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
    2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
    3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
    4. 4°C 孵育过夜。
    5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
    7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
    9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 23°C 避光保存。
     
    IHC
    实验步骤：
     
    脱蜡/补液
    1. 脱蜡/水合切片：
    2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
    4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
    5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
     
    染色
    1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
    3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
    5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
    6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
    7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
    9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
    11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
    12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
    13. 如果需要，用苏木精复染切片。
    14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
    16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性

    Anti-CD68 Rabbit Antibody [M20C19] 可检测内源性 CD68 总蛋白水平。
    蛋白定位
    细胞膜，内体，溶酶体，内膜系统
    Uniprot ID
    P34810
    克隆号
    M20C19
    别名
    CD68, Macrosialin, Cd68
    背景
    CD68是一种高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，主要定位于细胞的内体和溶酶体区室。其结构类似于溶酶体相关膜蛋白（LAMP），属于LAMP糖蛋白家族。它被广泛认为是髓系标记物，在巨噬细胞中表达尤其高。在人类CD68基因中，第一个内含子包含一个转录增强子，可驱动巨噬细胞特异性表达。在骨髓中，CD68以及其他巨噬细胞相关基因在髓系和淋巴系发育分化过程中，由共同髓系祖细胞中的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导。 CD68 高表达是单核吞噬细胞系统细胞的特征，包括巨噬细胞、小胶质细胞、破骨细胞和髓系树突状细胞。某些淋巴细胞群（例如 CD19⁺ B 细胞和 CD4⁺ T 细胞）以及粒细胞（例如嗜碱性粒细胞和肠中性粒细胞）中 CD68 的表达水平较低。在几种非造血细胞类型中也发现了较低的表达水平，包括人脐带间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、各种肿瘤细胞系和动脉内膜平滑肌细胞。人类和鼠 CD68 蛋白均具有广泛的 N 连接糖基化修饰，预测有 9 个糖基化位点，其中 4 个位于 LAMP 结构域内。
    参考文献
    • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27869795/

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