Anti-DFNA5/GSDME Rabbit Antibody [G9F19]

目录号: F1701

本抗体可识别全链 DFNA5/GSDME，以及 DFNA5/GSDME 裂解后的N端部分。如需获取不同样本的表达情况请点击“样品处理数据示例表”。

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: SH-SY5Y

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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客户使用该产品的实验数据

操作要点

本抗体可识别全链 DFNA5/GSDME，以及 DFNA5/GSDME 裂解后的N端部分。

DFNA5/GSDME蛋白仅在部分细胞\组织中表达，同时表达水平存在差异。进行WB实验时，建议设置阳性和阴性对照组来优化实验体系。
如需检测细胞样本中DFNA5/GSDME蛋白的N端片段，建议诱导处理 (如SH-SY5Y，60uM etoposide，14h处理以提高DFNA5/GSDME蛋白N端片段的表达丰度)。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:30 FCM1:60

抗体应用
WB, IP, FCM

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
54 kDa 37 kDa, 55 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	Mouse brain; Mouse liver; SH-SY5Y; EMT6; SGC-7901; HEK-293 (transfected with DDDDK tagged DFNA5/GSDME)
阴性对照	HEK-293

样品处理数据示例

样品	处理情况
MCF-7	Low Expression
点击查看更多样品数据

^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-DFNA5/GSDME Rabbit Antibody [G9F19] 可检测内源性总 DFNA5/GSDME 的蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，内膜

Uniprot ID
O60443

克隆号
G9F19

别名
cleaved N-terminal DFNA5,DFNA5/GSDME,Gasdermin E

背景
Gasdermin E (GSDME)，也称为耳聋常染色体显性 5 (DFNA5)，最初被确定为与常染色体显性遗传性听力损失相关的基因。气体蛋白家族成员以其通过成孔能力介导炎症细胞死亡的作用而闻名。气体蛋白结构域之间的裂解使氨基末端结构域能够与膜磷脂结合并寡聚化，在质膜上形成孔。该过程导致细胞快速肿胀，在质膜上形成大气泡，并最终导致细胞裂解，这是一种称为细胞焦亡的程序性坏死形式。气体蛋白 E (GSDME) 在气体蛋白中是独一无二的，因为它的激活需要被 caspase-3 裂解，caspase-3 是一种参与肿瘤细胞凋亡的酶。在许多类型的肿瘤细胞中，GSDME 由于其启动子区域的高甲基化而被沉默。然而，当 GSDME 表达时，它可以诱导肿瘤细胞死亡并增强抗肿瘤免疫力。在癌症生物学中，DFNA5 充当肿瘤抑制因子，抑制胃癌、黑色素瘤和结直肠癌细胞的菌落形成和细胞增殖，并降低乳腺癌的侵袭性行为。

背景

Gasdermin E (GSDME)，也称为耳聋常染色体显性 5 (DFNA5)，最初被确定为与常染色体显性遗传性听力损失相关的基因。气体蛋白家族成员以其通过成孔能力介导炎症细胞死亡的作用而闻名。气体蛋白结构域之间的裂解使氨基末端结构域能够与膜磷脂结合并寡聚化，在质膜上形成孔。该过程导致细胞快速肿胀，在质膜上形成大气泡，并最终导致细胞裂解，这是一种称为细胞焦亡的程序性坏死形式。气体蛋白 E (GSDME) 在气体蛋白中是独一无二的，因为它的激活需要被 caspase-3 裂解，caspase-3 是一种参与肿瘤细胞凋亡的酶。在许多类型的肿瘤细胞中，GSDME 由于其启动子区域的高甲基化而被沉默。然而，当 GSDME 表达时，它可以诱导肿瘤细胞死亡并增强抗肿瘤免疫力。在癌症生物学中，DFNA5 充当肿瘤抑制因子，抑制胃癌、黑色素瘤和结直肠癌细胞的菌落形成和细胞增殖，并降低乳腺癌的侵袭性行为。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34433433/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35292781/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%