Anti-EWSR1/EWS Rabbit Antibody [K7J15]

目录号: F3441

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: K562, Lane 2: HeLa, Lane 3: Jurkat, Lane 4: F9
Immunofluorescent analysis of Hela cells using F3441 (green, 1:500), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议一抗稀释比: 1:10000

使用信息

稀释比例
WB1:10000-1:50000 IHC1:250 - 1:500 IF1:500 - 1:1000 FCM1:100

抗体应用
WB, IHC, IF, FCM

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
68 kDa

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-EWSR1/EWS Rabbit Antibody [K7J15] 用于检测内源性 EWSR1/EWS 总的蛋白水平。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，内膜系统，细胞核

克隆号
K7J15

别名
EWS,EWSR1

背景
EWSR1（Ewing肉瘤RNA结合蛋白1）是由位于22q12.2染色体上的EWSR1基因编码的多功能蛋白，在转录、RNA剪接和基因组稳定性方面起着关键作用。它包含一个N端转激活域（TAD），与转录因子如TFIID和RNA聚合酶II相互作用，一个RNA结合域（RBD）用于RNA附着，以及多个低复杂度结构域（LCDs），有助于与核酸和蛋白质的动态相互作用。EWSR1在核质中存在两种视觉模式：分布状态和浓缩的焦点，这些焦点与染色质区域中的磷酸化RNA聚合酶II共定位，调节活跃转录。EWSR1通过其RBD和锌指结构域解决R环（三链核酸结构），以防止转录压力和基因组不稳定。在Ewing肉瘤中，EWSR1与FLI1等融合蛋白形成，这些融合蛋白通过招募组蛋白甲基转移酶和乙酰转移酶来改变染色质状态，激活癌基因如c-Myc，同时抑制肿瘤抑制基因如p53。这些融合蛋白还与增强子区域和微卫星重复序列相互作用，推动致癌转录程序。EWSR1功能丧失或突变导致减弱的减数分裂、早老、骨密度降低和免疫功能障碍。

背景

EWSR1（Ewing肉瘤RNA结合蛋白1）是由位于22q12.2染色体上的EWSR1基因编码的多功能蛋白，在转录、RNA剪接和基因组稳定性方面起着关键作用。它包含一个N端转激活域（TAD），与转录因子如TFIID和RNA聚合酶II相互作用，一个RNA结合域（RBD）用于RNA附着，以及多个低复杂度结构域（LCDs），有助于与核酸和蛋白质的动态相互作用。EWSR1在核质中存在两种视觉模式：分布状态和浓缩的焦点，这些焦点与染色质区域中的磷酸化RNA聚合酶II共定位，调节活跃转录。EWSR1通过其RBD和锌指结构域解决R环（三链核酸结构），以防止转录压力和基因组不稳定。在Ewing肉瘤中，EWSR1与FLI1等融合蛋白形成，这些融合蛋白通过招募组蛋白甲基转移酶和乙酰转移酶来改变染色质状态，激活癌基因如c-Myc，同时抑制肿瘤抑制基因如p53。这些融合蛋白还与增强子区域和微卫星重复序列相互作用，推动致癌转录程序。EWSR1功能丧失或突变导致减弱的减数分裂、早老、骨密度降低和免疫功能障碍。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38511874/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35740349/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%