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Anti-KLF4 Rabbit Antibody [K21G5]

目录号: F3780

    抗体应用： 反应性：
    规格 价格 库存 购买数量
    20uL 790 现货
    50uL 1240 现货
    100uL 1990 现货
    100uL*2 3790 现货

    400-668-6834

    info@selleck.cn

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    1:30
    1:2000
    1:100
    1:50
    Use 8µg for 10˄7 cells.
    抗体应用
    WB, IP, IHC, IF, FCM, ChIP
    反应性
    Human
    抗体类型
    Rabbit
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
    储存条件(自收到货起)
    -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    实际分子量
    54 kDa
    54 kDa, 81 kDa
    *为什么预测分子量和实际分子量会有不同？
    以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。
    阳性对照 Human stomach; Human gastric cancer; Human seminoma; NCCIT
    阴性对照

    实验方法

    WB
    实验步骤：
     
    样品制备
    1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
    2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
    6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
     
    转膜
    1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
    （注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
     
    封闭
    1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
    2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
    3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
    2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
    3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
    4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
    2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
     
    IF
    实验步骤：
     
    标本制备
    1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
    注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
    2. 室温固定细胞 15 分钟。
    3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色。
     
    免疫染色
    1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
    2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
    3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
    4. 4°C 孵育过夜。
    5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
    7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
    8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
    9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 23°C 避光保存。
     
    IHC
    实验步骤：
     
    脱蜡/补液
    1. 脱蜡/水合切片：
    2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
    4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
    5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
     
    染色
    1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
    3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
    5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
    6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
    7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
    9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
    11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
    12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
    13. 如果需要，用苏木精复染切片。
    14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
    16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性

    Anti-KLF4 Rabbit Antibody [K21G5] 可检测内源性 KLF4 总蛋白水平。
    蛋白定位
    细胞质，细胞核
    Uniprot ID
    O43474
    克隆号
    K21G5
    别名
    EZF, GKLF, KLF4, Krueppel-like factor 4, Epithelial zinc finger protein EZF, Gut-enriched krueppel-like factor
    背景
    KLF4 是 SP/KLF 转录因子家族的成员，其特点是 C 端区域有三个锌指结构域，能够实现 DNA 结合。N 端区域包含一个转录激活结构域 (TAD) 和一个抑制结构域。这两个区域共同作用，通过与其他蛋白质相互作用并影响 DNA 结合强度来决定 KLF4 的基因调控特异性。KLF4 的表达在转录和转录后水平均受到调控。在癌症和干细胞中，其活性可受表观遗传变化（例如启动子区 CpG 岛高甲基化和组蛋白甲基化）的调控。microRNA 也在调控 KLF4 水平方面发挥重要作用，尤其是在干细胞/祖细胞、心血管重塑和肿瘤进展中。此外，多种细胞信号通路通过其下游效应分子影响 KLF4 的转录。在翻译后阶段，KLF4 的功能可以通过特定的修饰来抑制。 ERK1/ERK2 对丝氨酸 132 位点的磷酸化促进了胚胎干细胞分化，并同时募集 F-box 蛋白 βTrCP1 或 βTrCP2 至其 N 端结构域，导致泛素化和蛋白质降解。p300/CBP 复合物介导的赖氨酸 225 和 229 位点的乙酰化会削弱其激活靶基因的能力。总而言之，KLF4 的活性受表观遗传调控、microRNA 调控、信号通路输入和靶向蛋白质修饰等多种因素的影响，使其能够在发育、干细胞维持和癌症等多种生物学环境中发挥作用。
    参考文献
    • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28237823/

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