Anti-LIM Kinase 1 Rabbit Antibody [M15H19]

目录号: F2350

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: HAP1
Lane 2: HAP1 (KO LIMK1)
Lane 3: SH SY5Y

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

操作要点

WB
建议曝光 300s 以上。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 -1: 10000

抗体应用
WB

反应性
Human

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
73 kDa

阳性对照	U-87 MG; SH SY5Y; Ramos; HAP1
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 300s 以上)

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 300s 以上)

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-LIM Kinase 1 Rabbit Antibody [M15H19] 检测内源性 LIM Kinase 1 总的蛋白水平。

蛋白定位
细胞突起，细胞质，细胞骨架，细胞核

Uniprot ID
P53667

克隆号
M15H19

别名
LIM Kinase 1,LIMK1

背景
肌动蛋白细胞骨架的组织对于许多细胞过程至关重要，包括存活、分化、增殖、胞质分裂、凋亡和运动。LIM 激酶 1 (LIMK1) 及其同源物 LIM 激酶 2 (LIMK2) 是丝氨酸蛋白激酶，通过磷酸化其底物蛋白（例如肌动蛋白解聚因子 (ADF) 和肌动蛋白丝切蛋白）来调控肌动蛋白动力学，从而控制肌动蛋白聚合。LIMK 蛋白的活性受 Rho GTPase 家族成员（包括 Rho、Rac 和 Cdc42）通过其下游效应物（例如 Rho 相关激酶 (ROCK) 和 p21 激活激酶 (PAK1 和 PAK4)）调控。这些激酶在激酶域的激活环内对 LIMK1 的苏氨酸 508 (Thr508) 进行磷酸化，从而导致其激活。同样，PAK1 和ROCK 分别在保守残基 Thr508 和 Thr505 处磷酸化 LIMK1 和 LIMK2，从而增强其活性。LIM 激酶与磷酸酶 SSH-1 共同，是肌动蛋白丝切蛋白介导的突起动力学的关键调控因子。LIMK1 通过在细胞反应的初始阶段促进板状伪足的形成来促进细胞迁移，而 SSH-1 通过将突起形成限制在单一方向来指导迁移，确保协调运动。LIMK1 和 LIMK2 共享一个保守域结构，包括两个 N 端 LIM 域、一个 PDZ 域、一个富含丝氨酸/脯氨酸的区域和一个 C 端激酶域。除了在肌动蛋白调控中的作用外，LIM 激酶也是肌动蛋白和微管动力学协调不可或缺的一部分。 LIM 激酶与肌动蛋白和微管蛋白相互作用，ROCK 介导的 LIMK1 磷酸化促进肌动蛋白相互作用，同时减少其与微管蛋白的结合。LIMK1 的过度表达会使微管不稳定，这一过程依赖于其激酶活性。相反，抑制 ROCK 会稳定涉及 LIMK1、TPPP1 和 HDAC6（组蛋白去乙酰化酶 6）的三聚体复合物，影响微管蛋白乙酰化和微管稳定性。LIMK 过表达可导致微管蛋白乙酰化和微管稳定，而 TPPP1 过表达会导致肌动蛋白磷酸化降低和应激纤维破坏。

背景

肌动蛋白细胞骨架的组织对于许多细胞过程至关重要，包括存活、分化、增殖、胞质分裂、凋亡和运动。LIM 激酶 1 (LIMK1) 及其同源物 LIM 激酶 2 (LIMK2) 是丝氨酸蛋白激酶，通过磷酸化其底物蛋白（例如肌动蛋白解聚因子 (ADF) 和肌动蛋白丝切蛋白）来调控肌动蛋白动力学，从而控制肌动蛋白聚合。LIMK 蛋白的活性受 Rho GTPase 家族成员（包括 Rho、Rac 和 Cdc42）通过其下游效应物（例如 Rho 相关激酶 (ROCK) 和 p21 激活激酶 (PAK1 和 PAK4)）调控。这些激酶在激酶域的激活环内对 LIMK1 的苏氨酸 508 (Thr508) 进行磷酸化，从而导致其激活。同样，PAK1 和ROCK 分别在保守残基 Thr508 和 Thr505 处磷酸化 LIMK1 和 LIMK2，从而增强其活性。LIM 激酶与磷酸酶 SSH-1 共同，是肌动蛋白丝切蛋白介导的突起动力学的关键调控因子。LIMK1 通过在细胞反应的初始阶段促进板状伪足的形成来促进细胞迁移，而 SSH-1 通过将突起形成限制在单一方向来指导迁移，确保协调运动。LIMK1 和 LIMK2 共享一个保守域结构，包括两个 N 端 LIM 域、一个 PDZ 域、一个富含丝氨酸/脯氨酸的区域和一个 C 端激酶域。除了在肌动蛋白调控中的作用外，LIM 激酶也是肌动蛋白和微管动力学协调不可或缺的一部分。 LIM 激酶与肌动蛋白和微管蛋白相互作用，ROCK 介导的 LIMK1 磷酸化促进肌动蛋白相互作用，同时减少其与微管蛋白的结合。LIMK1 的过度表达会使微管不稳定，这一过程依赖于其激酶活性。相反，抑制 ROCK 会稳定涉及 LIMK1、TPPP1 和 HDAC6（组蛋白去乙酰化酶 6）的三聚体复合物，影响微管蛋白乙酰化和微管稳定性。LIMK 过表达可导致微管蛋白乙酰化和微管稳定，而 TPPP1 过表达会导致肌动蛋白磷酸化降低和应激纤维破坏。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15023529/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36899941/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%