Anti-Netrin 1 Rabbit Antibody [B4C16]

目录号: F1639

抗体应用：反应性：Mouse, Rat, Human

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
建议使用1% SDS 热裂解制备裂解物。常规方法可能使检测到的蛋白信号较弱。

使用信息

稀释比例
WB1:500 - 1:10000 IP1:1500

抗体应用
WB, IP

反应性
Mouse, Rat, Human

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量实际分子量
67 kDa 75 kDa
^*为什么预测分子量和实际分子量会有不同？以下原因可能会导致蛋白分子量与预测不同：翻译后修饰（磷酸化/糖基化）；剪接变体和异构体；相对电荷；多聚体。

阳性对照	Rat brain (prepared in 1%SDS Hot lysis method at 20 µg); Mouse kidney tissue; Mouse heart tissue; Rat kidney tissue; Human fetal brain tissue; Human small intestine; Mouse aorta (Ang II-treated); MCF7
阴性对照	Mouse aorta (PBS-treated); Rat brain (prepared in RIPA lysis method)

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-Netrin 1 Rabbit Antibody [B4C16] 可检测内源性 Netrin 1 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，细胞外环境

Uniprot ID
O95631

克隆号
B4C16

别名
NTN1L, NTN1, Netrin-1, Epididymis tissue protein Li 131P

背景
Netrin-1 是一种多功能的引导蛋白，属于 Netrin 家族，其主要功能是指导轴突生长、神经元迁移和突触形成，从而在神经系统发育中发挥关键作用。Netrin-1 由一个 N 端层粘连蛋白样结构域、三个表皮生长因子 (EGF) 样重复序列和一个带正电荷的 C 端小结构域组成。这种独特的结构使 Netrin-1 能够同时与多个受体（例如 DCC 和 UNC5）相互作用，从而触发吸引或排斥信号通路。这些通路通过调节生长锥（轴突尖端的动态结构）内的细胞骨架动力学和细胞粘附机制，引导生长中的轴突到达目标。Netrin-1 通过促进内皮细胞存活、迁移和血管形成来调节血管生成，并通过影响白细胞粘附和迁移来调节免疫细胞运输。它还通过激活促存活通路和抑制胱天蛋白酶活性来抑制细胞凋亡，从而介导细胞存活。Netrin-1信号在空间和时间上受到严格控制，其表达受发育线索和环境因素调控。它与多种辅助受体和细胞外基质成分相互作用，可根据环境产生多种细胞反应。Netrin-1通过促进肿瘤细胞存活、增强转移性扩散以及通过血管生成和免疫逃逸来调节肿瘤微环境，从而参与癌症进展。

背景

Netrin-1 是一种多功能的引导蛋白，属于 Netrin 家族，其主要功能是指导轴突生长、神经元迁移和突触形成，从而在神经系统发育中发挥关键作用。Netrin-1 由一个 N 端层粘连蛋白样结构域、三个表皮生长因子 (EGF) 样重复序列和一个带正电荷的 C 端小结构域组成。这种独特的结构使 Netrin-1 能够同时与多个受体（例如 DCC 和 UNC5）相互作用，从而触发吸引或排斥信号通路。这些通路通过调节生长锥（轴突尖端的动态结构）内的细胞骨架动力学和细胞粘附机制，引导生长中的轴突到达目标。Netrin-1 通过促进内皮细胞存活、迁移和血管形成来调节血管生成，并通过影响白细胞粘附和迁移来调节免疫细胞运输。它还通过激活促存活通路和抑制胱天蛋白酶活性来抑制细胞凋亡，从而介导细胞存活。Netrin-1信号在空间和时间上受到严格控制，其表达受发育线索和环境因素调控。它与多种辅助受体和细胞外基质成分相互作用，可根据环境产生多种细胞反应。Netrin-1通过促进肿瘤细胞存活、增强转移性扩散以及通过血管生成和免疫逃逸来调节肿瘤微环境，从而参与癌症进展。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24876346/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25123307/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%