Anti-OxPhos Complex IV subunit IV Mouse Antibody [P16M14]

目录号: F3930

抗体应用：反应性：Bovine, Human, Mouse, Rat, Zebrafish

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:2000

抗体应用
WB

反应性
Bovine, Human, Mouse, Rat, Zebrafish

抗体类型
Mouse

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-OxPhos Complex IV subunit IV Mouse Antibody [P16M14] 可检测内源性 OxPhos Complex IV subunit IV 总蛋白水平。

蛋白定位
内膜系统，线粒体，线粒体内膜

Uniprot ID
P13073

克隆号
P16M14

别名
Cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1, mitochondrial; Cytochrome c oxidase polypeptide IV; Cytochrome c oxidase subunit IV isoform 1 (COX IV-1); COX4I1; COX4

背景
氧磷酸化复合物IV亚基IV (COX4)是复合物IV的一个关键的核编码亚基，复合物IV又称细胞色素c氧化酶(COX)，是线粒体电子传递链中的末端酶。复合物IV催化电子从细胞色素c转移到分子氧，将其还原为水，同时将质子泵过线粒体内膜，从而建立ATP合成所需的质子动力。该复合物由14个亚基组成，包括三个线粒体DNA编码的催化核心亚基(COX1-3)，它们含有电子转移所必需的血红素和铜中心，以及几个核编码的辅助亚基，例如COX4，它们参与复合物的稳定和调控。COX4包含功能结构域，可促进与其他亚基和调节蛋白的相互作用，从而帮助细胞色素c结合并提高质子泵送效率。COX4也在复合物IV的组装和生物合成中发挥关键作用。它与线粒体伴侣蛋白（例如mtHsp70和Mge1）相互作用，形成伴侣蛋白亚基复合物，支持COX4高效地整合到酶复合物中，并促进呼吸超级复合物的形成，尤其是在热休克等应激条件下。COX4的缺失或损耗会严重干扰复合物IV的组装和功能，导致细胞色素c氧化酶活性降低、线粒体呼吸功能受损、膜电位降低以及ATP生成减少。

背景

氧磷酸化复合物IV亚基IV (COX4)是复合物IV的一个关键的核编码亚基，复合物IV又称细胞色素c氧化酶(COX)，是线粒体电子传递链中的末端酶。复合物IV催化电子从细胞色素c转移到分子氧，将其还原为水，同时将质子泵过线粒体内膜，从而建立ATP合成所需的质子动力。该复合物由14个亚基组成，包括三个线粒体DNA编码的催化核心亚基(COX1-3)，它们含有电子转移所必需的血红素和铜中心，以及几个核编码的辅助亚基，例如COX4，它们参与复合物的稳定和调控。COX4包含功能结构域，可促进与其他亚基和调节蛋白的相互作用，从而帮助细胞色素c结合并提高质子泵送效率。COX4也在复合物IV的组装和生物合成中发挥关键作用。它与线粒体伴侣蛋白（例如mtHsp70和Mge1）相互作用，形成伴侣蛋白亚基复合物，支持COX4高效地整合到酶复合物中，并促进呼吸超级复合物的形成，尤其是在热休克等应激条件下。COX4的缺失或损耗会严重干扰复合物IV的组装和功能，导致细胞色素c氧化酶活性降低、线粒体呼吸功能受损、膜电位降低以及ATP生成减少。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17091399/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23864706/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%