Anti-Phospho-Akt (Ser473) Rabbit Antibody [B19D19]

目录号: F3507

抗体应用：反应性：Human, Mouse, Rat

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:200 IF1:100 - 1:200 FCM1:200 - 1:800

抗体应用
WB, IP, IF, FCM

反应性
Human, Mouse, Rat

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
60 kDa

阳性对照	SK-MEL-28 (human Insulin, 100 nM, 20 min); NIH/3T3 (mouse PDGF-BB, 100 ng/mL, 20 min); H-4-II-E (human IGF-1, 100 ng/mL, 5 min); NIH/3T3 (PDGF-treated and pretreated with wortmannin/rapamycin); 3T3 (PDGF, 100ng/mL, 15 min); MCF-7 (hIGF-1, 100ng/ml, 10 mins)
阴性对照	SK-MEL-28; NIH/3T3; H-4-II-E; 3T3; MCF-7

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

IF
实验步骤：标本制备 1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。 2. 室温固定细胞 15 分钟。 3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。 4. 继续进行免疫染色。免疫染色 1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。 2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。 3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。 4. 4°C 孵育过夜。 5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。 7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。 9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 23°C 避光保存。

实验步骤：

标本制备

1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。

注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

2. 室温固定细胞 15 分钟。

3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。

4. 继续进行免疫染色。

免疫染色

1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。

2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。

3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。

4. 4°C 孵育过夜。

5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。

7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。

9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 23°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-Phospho-Akt (Ser473) Rabbit Antibody [B19D19] 仅识别 Ser473 处磷酸化的内源性 Akt1 蛋白水平。当 Akt2 和 Akt3 在相应残基磷酸化时，该抗体也能识别 Akt2 和 Akt3。

蛋白定位
细胞膜，细胞质，内体，内膜系统，细胞核，线粒体

Uniprot ID
P31751, Q9Y243, P31749

克隆号
B19D19

别名
RAC-beta serine/threonine-protein kinase, Protein kinase Akt-2, Protein kinase B beta (PKB beta), RAC protein kinase beta, AKT2, RAC-gamma serine/threonine-protein kinase, Protein kinase Akt-3, Protein kinase B gamma (PKB gamma), RAC-PK-gamma, STK-2, AKT3, PKBG, RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, Protein kinase B (PKB), Protein kinase B alp

背景
Akt，又称蛋白激酶B (PKB) 或 Rac，是细胞存活和凋亡的关键调控因子。它通过对渥曼青霉素敏感的PI3激酶依赖性通路，由胰岛素以及多种生长和存活因子激活。Akt1、Akt2 和 Akt3 三种亚型中，Akt1 在癌症和代谢领域研究最为广泛。Akt1 是磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸 (PIP3) 信号级联的核心效应子，属于 AGC 家族，该家族包含 60 多种蛋白激酶，其中许多蛋白激酶通过活化环和 C 末端尾部的磷酸化进行调控。在某些 AGC 激酶中，C 末端磷酸化位点会自然地被酸性天冬氨酸取代；而对于 Akt1 而言，S473D 替换模拟了 Ser473 磷酸化状态。除了典型的Ser473磷酸化外，Akt1还可以在细胞核内被Cdk2/cyclinA2在Ser477和Thr479位点磷酸化。这些非典型的C端修饰被认为可以在核区激活Akt1并促进细胞周期进程。利用Asp/Glu取代和肽互补的机制研究表明，这些修饰通过类似于Ser473磷酸化的途径激活Akt1。功能上，Akt通过抑制凋亡来支持细胞存活，这是通过磷酸化和失活多个促凋亡靶点（包括Bad、叉头转录因子、c-Raf和caspase-9）实现的。Akt还通过直接磷酸化雷帕霉素敏感的mTOR-raptor复合物中的mTOR以及失活mTOR负调控因子结节蛋白(TSC2)来驱动细胞生长，从而维持mTOR通路的激活。

背景

Akt，又称蛋白激酶B (PKB) 或 Rac，是细胞存活和凋亡的关键调控因子。它通过对渥曼青霉素敏感的PI3激酶依赖性通路，由胰岛素以及多种生长和存活因子激活。Akt1、Akt2 和 Akt3 三种亚型中，Akt1 在癌症和代谢领域研究最为广泛。Akt1 是磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸 (PIP3) 信号级联的核心效应子，属于 AGC 家族，该家族包含 60 多种蛋白激酶，其中许多蛋白激酶通过活化环和 C 末端尾部的磷酸化进行调控。在某些 AGC 激酶中，C 末端磷酸化位点会自然地被酸性天冬氨酸取代；而对于 Akt1 而言，S473D 替换模拟了 Ser473 磷酸化状态。除了典型的Ser473磷酸化外，Akt1还可以在细胞核内被Cdk2/cyclinA2在Ser477和Thr479位点磷酸化。这些非典型的C端修饰被认为可以在核区激活Akt1并促进细胞周期进程。利用Asp/Glu取代和肽互补的机制研究表明，这些修饰通过类似于Ser473磷酸化的途径激活Akt1。功能上，Akt通过抑制凋亡来支持细胞存活，这是通过磷酸化和失活多个促凋亡靶点（包括Bad、叉头转录因子、c-Raf和caspase-9）实现的。Akt还通过直接磷酸化雷帕霉素敏感的mTOR-raptor复合物中的mTOR以及失活mTOR负调控因子结节蛋白(TSC2)来驱动细胞生长，从而维持mTOR通路的激活。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30078705/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%