Home 一抗 Anti-Phospho-Erk1 (Tyr204)/Erk2 (Tyr187) Mouse Antibody [H17M24] 仅限科研使用

Anti-Phospho-Erk1 (Tyr204)/Erk2 (Tyr187) Mouse Antibody [H17M24]

目录号: F0502

    抗体应用： 反应性：
    • Lane 1: A-431, Lane 2: A-431 (U0126 treated), Lane 3: A-431 (hEGF treated), Lane 4: C6, Lane 5: C6 (TPA treated)
    • Immunofluorescent analysis of Hela cells,treated with PDBu (100 nM, 15 min), using F0502 (green, 1:200), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
    规格 价格 库存 购买数量
    20ul 790 现货
    50uL 1240 现货
    100ul 1990 现货
    100uL*2 3790 现货

    400-668-6834

    info@selleck.cn

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    1:200
    1:400 - 1:1600
    抗体应用
    WB, IF, FCM
    反应性
    Human, Mouse, Rat, Monkey
    抗体类型
    Mouse
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
    储存条件(自收到货起)
    –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    42 kDa, 44 kDa
    阳性对照 A-431; A-431(serum-starved overnight; hEGF-treated); Hela(serum-starved overnight; TPA-treated); C6(serum-starved overnight; TPA-treated); COS-7(serum-starved overnight; hEGF-treated)
    阴性对照

    样品处理数据示例

    样品 处理情况
    A-431 Serum starvation overnight
    A-431 Serum starvation overnight; hEGF treatment
    Hela Serum starvation overnight; TPA treatment
    C6 Serum starvation overnight; TPA treatment
    COS-7 Serum starvation overnight; hEGF treatment
    点击查看更多样品数据

    *该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

    实验方法

    WB
    实验步骤：
     
    样品制备
    1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
    2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
    6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
     
    转膜
    1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
    （注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
     
    封闭
    1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
    2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
    3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
    2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
    3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
    4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
    2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
     
    IF
    实验步骤：
    样品准备
    1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
    2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
    3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
    4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
     
    固定
    1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
    2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
     
    通透
    1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
    （仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
    2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
     
    封闭
    添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
    注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
     
    免疫荧光染色（第一天）
    1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
    2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
     
    免疫荧光染色（第二天）
    1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
    2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
    3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
    4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
    5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
     
    封片
    1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
    2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
    3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
    IHC
    实验步骤：
     
    脱蜡/补液
    1. 脱蜡/水合切片：
    2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
    4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
    5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
     
    染色
    1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
    3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
    5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
    6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
    7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
    9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
    11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
    12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
    13. 如果需要，用苏木精复染切片。
    14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
    15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
    16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性

    Anti-Phospho-Erk1 (Tyr204)/Erk2 (Tyr187) Mouse Antibody [H17M24] 可识别内源水平的 p44/42 MAPK/Erk 蛋白。 该抗体可检测双磷酸化 p44 MAPK/Erk1 (Thr202/Tyr204)/p42 MAPK/Erk2 (Thr185/Tyr187)，但不检测苏氨酸单磷酸化 p44/42 MAPK/Erk。 该抗体不与任何其他 MAP 激酶发生交叉反应。
    蛋白定位
    细胞连接，细胞质，内膜，细胞核
    Uniprot ID
    P27361, P28482
    克隆号
    H17M24
    别名
    Phospho p44 MAPK (Tyr 204), Phospho p42 MAPK (Tyr 187), Phospho p44 ERK1 (Tyr 204), Phospho p42 ERK2 (Tyr 187)
    背景

    丝裂原激活蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinases, MAPK) 是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，对许多细胞过程至关重要，包括增殖、分化、运动和凋亡。 p44/42 MAPK (Erk1/2) 信号通路响应各种细胞外信号（例如丝裂原、生长因子和细胞因子）而被激活，使其成为癌症诊断和治疗的重要靶点。 p44/42 MAPK 通路的激活在介导细胞对不同刺激的反应中发挥着关键作用，凸显了其在细胞信号传导和疾病发病机制中的重要性。
    参考文献
    • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15187187/
    • [2] Meloche S, et al. Oncogene. 2007 May 14;26(22):3227-39.

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