Anti-Phospho-Ubiquitin (Ser65) Rabbit Antibody [C22F3]

目录号: F1476

抗体应用：反应性：Human

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100

抗体应用
WB, IP

反应性
Human

抗体类型
Rabbit

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

阳性对照	PC-3 (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone, 30 μM, 6 h)
阴性对照	PC-3

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-Phospho-Ubiquitin (Ser65) Rabbit Antibody [C22F3] 仅识别 Ser65 处磷酸化的内源性 Ubiquitin 总蛋白水平。

蛋白定位
细胞质，细胞核，内膜系统，线粒体，线粒体外膜

Uniprot ID
P62987, P0CG48, P0CG47, P62979

克隆号
C22F3

别名
Ubiquitin-ribosomal protein eL40 fusion protein, CEP52, Ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1, UBA52, UBCEP2, Polyubiquitin-C, UBC, Polyubiquitin-B, UBB, Ubiquitin-ribosomal protein eS31 fusion protein, Ubiquitin carboxyl extension protein 80, RPS27A, UBA80, UBCEP1

背景
泛素是一种高度保守的多肽，在泛素-蛋白酶体系统中发挥核心作用，而泛素-蛋白酶体系统是调节细胞内蛋白质降解的关键机制。通过泛素化过程，泛素分子共价连接到特定的细胞蛋白质上，标记这些蛋白质，以便被26S蛋白酶体降解。泛素化级联反应涉及三个主要的酶促步骤：首先，泛素被E1酶激活，形成硫酯键。然后，该激活的泛素被转移到E2泛素结合酶上。最后，E3泛素连接酶通过将泛素连接到底物赖氨酸残基的ε氨基上，促进泛素从E2转移到靶蛋白上。泛素-蛋白酶体通路对多种生理过程至关重要，包括细胞周期调控、分化、细胞应激反应以及细胞凋亡。该通路失调与多种疾病相关。其中一种调控机制涉及激酶PINK1对泛素65位丝氨酸的磷酸化，从而激活E3连接酶Parkin——这是线粒体质量控制的关键步骤。IκB、p53、cdc25A和Bcl-2是泛素-蛋白酶体系统的已知底物，突显了其在维持细胞稳态和控制免疫反应、DNA修复和程序性细胞死亡等重要功能方面发挥的重要作用。

背景

泛素是一种高度保守的多肽，在泛素-蛋白酶体系统中发挥核心作用，而泛素-蛋白酶体系统是调节细胞内蛋白质降解的关键机制。通过泛素化过程，泛素分子共价连接到特定的细胞蛋白质上，标记这些蛋白质，以便被26S蛋白酶体降解。泛素化级联反应涉及三个主要的酶促步骤：首先，泛素被E1酶激活，形成硫酯键。然后，该激活的泛素被转移到E2泛素结合酶上。最后，E3泛素连接酶通过将泛素连接到底物赖氨酸残基的ε氨基上，促进泛素从E2转移到靶蛋白上。泛素-蛋白酶体通路对多种生理过程至关重要，包括细胞周期调控、分化、细胞应激反应以及细胞凋亡。该通路失调与多种疾病相关。其中一种调控机制涉及激酶PINK1对泛素65位丝氨酸的磷酸化，从而激活E3连接酶Parkin——这是线粒体质量控制的关键步骤。IκB、p53、cdc25A和Bcl-2是泛素-蛋白酶体系统的已知底物，突显了其在维持细胞稳态和控制免疫反应、DNA修复和程序性细胞死亡等重要功能方面发挥的重要作用。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10939967/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24751536/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%