Anti-PLK1 Mouse Antibody [F22N13]

目录号: F3264

抗体应用：反应性：Human

Lane 1: U2OS, Lane 2: HeLa, Lane 3: A431
Immunofluorescent analysis of Hela cells using F3264 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IF1:100 FCM1:50

抗体应用
WB, IF, FCM

反应性
Human

抗体类型
Mouse

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
68 kDa

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

IF

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Anti-PLK1 Mouse Antibody [F22N13] 用于检测内源性 PLK1 总的蛋白水平。

蛋白定位
着丝粒，染色体，细胞质，细胞骨架，动粒，细胞核

克隆号
F22N13

别名
Plk,PLK1

背景
Plk1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞周期各阶段（尤其是有丝分裂期间）的调控中起核心作用。从结构上看，Plk1由N端催化激酶结构域和C端polo盒结构域（PBD）组成，后者有助于底物识别及定位到特定的有丝分裂结构。Plk1对中心体成熟、纺锤体组装、染色体排列、姐妹染色单体分离以及胞质分裂均必不可少。它通过磷酸化激活关键有丝分裂调控因子（如Cdc25C和Myt1），确保细胞正确分裂；同时，Plk1还参与DNA损伤反应，通过调控检查点蛋白并促进从G2期DNA损伤检查点的恢复，其活性受磷酸化、蛋白相互作用及亚细胞定位调控，峰值出现在G2/M转换期。Plk1还参与上皮-间质转化（EMT）、自噬、凋亡和代谢重编程等非有丝分裂功能，并通过磷酸化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）增强戊糖磷酸途径以支持癌细胞的生物合成。Plk1的失调或过表达常见于癌症，且与促进细胞增殖、转化、EMT和基因组不稳定性有关，预后较差；此外，它还与肿瘤抑制因子p53通过自调回路相互作用，在DNA损伤条件下抑制p53的促凋亡功能，同时受到p53的转录抑制。

背景

Plk1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞周期各阶段（尤其是有丝分裂期间）的调控中起核心作用。从结构上看，Plk1由N端催化激酶结构域和C端polo盒结构域（PBD）组成，后者有助于底物识别及定位到特定的有丝分裂结构。Plk1对中心体成熟、纺锤体组装、染色体排列、姐妹染色单体分离以及胞质分裂均必不可少。它通过磷酸化激活关键有丝分裂调控因子（如Cdc25C和Myt1），确保细胞正确分裂；同时，Plk1还参与DNA损伤反应，通过调控检查点蛋白并促进从G2期DNA损伤检查点的恢复，其活性受磷酸化、蛋白相互作用及亚细胞定位调控，峰值出现在G2/M转换期。Plk1还参与上皮-间质转化（EMT）、自噬、凋亡和代谢重编程等非有丝分裂功能，并通过磷酸化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）增强戊糖磷酸途径以支持癌细胞的生物合成。Plk1的失调或过表达常见于癌症，且与促进细胞增殖、转化、EMT和基因组不稳定性有关，预后较差；此外，它还与肿瘤抑制因子p53通过自调回路相互作用，在DNA损伤条件下抑制p53的促凋亡功能，同时受到p53的转录抑制。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25949173/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%