Cyclin D1 (C-terminal) Rabbit mAb
目录号: F2524
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Lane 1: A549
Lane 2: A549 (KO CCND1)
Lane 3: SH-SY5Y
Lane 4: Mouse kidney
Lane 5: Mouse spleen
Lane 6: Rat heart
操作要点
蛋白定位：细胞质, 内膜, 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比 1:10000。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比 1:10000。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 34 kDa |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Cyclin D1 (C-terminal) Rabbit mAb 检测内源性 Cyclin D1 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| Cyclin D,Cyclin D1 |
| 克隆号 |
|---|
| A1D5 |
| 背景 |
|---|
细胞周期关键调控因子 Cyclin D1 通过驱动不受控制的细胞增殖在癌症发展中发挥关键作用。它是一种 36 kDa 蛋白质，由位于 11q13 染色体上的 CCND1 基因编码。从结构上讲，Cyclin D1 包含一个 RB 蛋白结合域、一个用于结合细胞周期依赖性激酶 (CDK) 或其抑制因子的区域、一个用于辅助激活因子募集的 LxxLL 基序、一个用于降解的 PEST 序列和一个调控核输出和蛋白质稳定性的关键苏氨酸残基。除了来自骨髓干细胞系的细胞外，Cyclin D1 在大多数正常人细胞中都有表达。生长因子可快速诱导其表达，使其能够整合和调控控制细胞增殖的多种细胞内信号通路。Cyclin D1 表达、积累、泛素化和与其同源 CDK 组装的失调会导致细胞过度生长，从而使 Cyclin D1 成为癌症的致癌驱动因素如乳腺癌、肺癌和黑色素瘤。虽然其表达在正常细胞中受到严格调控，但癌细胞会利用各种机制来放大 Cyclin D1 活性。Cyclin D1 通过充当 CDK4 和 CDK6 的变构调控因子来促进 G1 到 S 阶段的转变。活性 Cyclin D1/CDK4 复合物进入细胞核，在那里它与 Cyclin E/CDK2 共同磷酸化视网膜母细胞瘤 (RB) 蛋白。这种磷酸化释放了 RB 介导的 E2F 转录因子抑制，从而实现了细胞增殖所必需的基因的转录。Cyclin D1 水平升高会导致不受控制的增殖和肿瘤生长，强调其在癌症发病机制中的核心作用。除了其典型的 CDK 依赖性功能外，Cyclin D1 还表现出 CDK 非依赖性活性，充当转录调控因子。它通过与各种转录因子相互作用来影响细胞周期控制和增殖。细胞周期蛋白 D1 还与核受体（如 ERα、AR、过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ)、甲状腺激素受体β (TR-β)）及其共调控因子相互作用，影响细胞周期、生长和分化。此外，它控制特定微小 RNA (miRNA) 的表达，并显著促进肿瘤-基质相互作用，从而放大各种癌症特征。细胞周期蛋白 D1 在癌症发生和发展中的多方面作用反映了其作为 CDK 依赖性和 CDK 非依赖性细胞功能调控因子的复杂性。 |
| 参考文献 |
|---|
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