DGCR8 Rabbit mAb

目录号: F2027

  • Lane 1: 293
    Lane 2: Hela
    Lane 3: Neuro-2a
    Lane 4: 3T3
规格 价格 库存 购买数量
20uL 790 现货
50uL 1240 现货
100uL 1990 现货
100uL*2 3790 现货
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操作要点

蛋白定位:细胞核
WB
建议使用 RIPA/Nuclear Lysis Buffer 制备裂解物。

使用信息

稀释比例
1:1000
1:50
1:1000
1:1000
抗体应用
WB, IP, IF, FCM
抗体类型
Rabbit
反应性
Human, Mouse, Rat
储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
预测分子量
86 kDa
阳性对照 " Mouse testis; Human fetal kidney; Mouse brain; Rat brain; Jurkat; HeLa; HEK-293; WEHI-3; Neuro-2a; PC-12; NIH/3T3; A549; PC-3"
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤:
 
样品制备
1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含PMSF),低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
 
转膜
1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜)。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件:200 mA, 120 min。(电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
 
封闭(可选)
1. 电转移后,室温下用 TBS 洗膜 5 min;
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:1000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤:
 
标本制备
1. 吸出液体,然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意:多聚甲醛有毒,只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液,用 1X PBS 冲洗 3 次,每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液,加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中,室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果,请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存,请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 

Datasheet & SDS

生物描述

特异性

DGCR8 Rabbit mAb 可检测内源性总 DGCR8 的蛋白水平。

Uniprot ID
Q8WYQ5
克隆号
H18F12
背景

DGCR8(DiGeorge 综合征关键区域8 )是一种 RNA 结合蛋白,对 miRNA 生物合成和基因调控至关重要。它与细胞核中的 Drosha 形成“微处理器”复合物,将初级 miRNA(pri-miRNA)转化为前体 miRNA(pre-miRNA)。DGCR8 包含一个 WW 结构域和两个双链 RNA 结合结构域 (dsRBD),可特异性识别 RNA 底物。其活性通过多种机制调控:Ser 153 上的磷酸化可增强 DNA 修复和细胞对紫外线损伤的抵抗力;MeCP2 与 dsRBD 结合可阻止 Drosha 结合;血红素基团促进 DGCR8 二聚化,促进 miRNA 加工;脱乙酰化可提高加工效率。此外,DGCR8 在 23 个位点被磷酸化,可能涉及 ERK/MAPK 和其他激酶,从而增强其稳定性。除了 miRNA 加工外,DGCR8 还调控某些 mRNA 和 snoRNA 的稳定性,在 RNA 代谢、维持基因调控平衡和细胞完整性方面发挥多种作用。

参考文献

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