Eps15 Rabbit mAb
目录号: F1282
-
Lane 1: Hela
Lane 2: A431
Lane 3: A172
Lane 4: HCT-15
Lane 5: NCI-H226
Lane 6: T-470
Lane 7: MCF7
Lane 8: CCRF-CEM
Lane 9: SR
操作要点
WB
蛋白定位
细胞膜；包被小窝；细胞质；胞内体；内膜
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IF |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 138 kDa |
| 阳性对照 | A-431, A172, HCT-15, NCl-H226, T-47D, MCF7, CCRF-CEM, SR, U-251 MG |
|---|---|
| 阴性对照 |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 | ||||
| A-431 | Serum starvation | ||||
| A-431 | hEGF (100 ng/mL, 1 hr, 4ºC) | ||||
| 点击查看更多样品数据 | |||||
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜 (湿转法参考条件: 200mA 150min)。
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。 |
| IF |
|---|
实验步骤：
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
Eps15 Rabbit mAb别内源性Eps15总蛋白。根据序列比对，该抗体可与Eps15a和Eps15b反应。该抗体不与Eps15R发生交叉反应。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P42566 |
| 克隆号 |
|---|
| D10D13 |
| 背景 |
|---|
Eps15（EGFR 通路底物 15）最初被确定为 EGFR 激酶活性的底物。它具有三部分结构，包括具有三个 EH 结构域的 NH2 末端部分、中央假定的卷曲螺旋区域和具有多个天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸三联体的 COOH 末端结构域。 Eps15 位于网格蛋白小窝，与网格蛋白组装复合物 AP-2 和 AP-2 结合蛋白 Epsin 相互作用。破坏 Eps15 和 Epsin 的功能会抑制 EGF 和转铁蛋白的受体介导内吞作用，表明它们在内吞机制中发挥作用，包括突触囊泡膜内吞作用。如电子显微镜所示，Eps15 与 AP-2、Synaptojanin1 和 Epsin 结合，与质膜网格蛋白小窝和囊泡共定位，并位于出芽小窝的边缘。微注射抗 Eps15 抗体可抑制 EGF 和转铁蛋白的内化，而 Eps15 的 COOH 末端区域 (aa 529-897) 的过度表达通过阻止 Eps15 与 AP-2 复合物结合，充当内吞作用的显性负抑制剂。 |
| 参考文献 |
|---|
技术支持
在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。
* 必填项
