HDAC8 Rabbit mAb
目录号: F2218
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Lane 1: K562
Lane 2: Molt4
Lane 3: Hela
操作要点
蛋白定位：细胞质; 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-234 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, FCM |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Mouse |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
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| 42 kDa |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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HDAC8 Rabbit mAb 用于检测内源性 HDAC8 总的蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| HDAC8 |
| 背景 |
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组蛋白去乙酰化酶 8 (HDAC8) 是一种 I 类组蛋白去乙酰化酶，由位于 Xq13.1 染色体上的 HDAC8 基因编码，负责催化组蛋白和非组蛋白的去乙酰化，从而调控基因转录和细胞功能。从结构上看，HDAC8 形成头对头二聚体，每个分子含有一个锌结合催化位点和两个钾结合位点，以保证结构稳定性。其活性位点包括一条通向催化核心的疏水通道，锌离子可促进去乙酰化。虽然最初被描述为核蛋白，但 HDAC8 表现出核定位和细胞质定位，受 AMPK 介导的磷酸化事件的影响。HDAC8 广泛表达于平滑肌细胞、脑细胞和黑色素瘤细胞中，在癌症进展、免疫逃避和非癌症疾病（如 Cornelia de Lange 综合征、心血管疾病和肌病）中发挥关键作用。其转录受 FOXO1/3、SOX4 和 CREB1 等因子调控，而 microRNA 抑制其翻译，使 HDAC8 成为治疗干预的关键靶点。 |
| 参考文献 |
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