LC3B Rabbit mAb

目录号: F0145

Lane 1: HCT 116
Lane 2: HCT 116 (KO LC3B)
Lane 3: Hela
Lane 4: Hela (KD LC3B)

规格	价格	库存
20ul	790	现货
50uL	1240	现货
100ul	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
蛋白定位
细胞质; 胞质囊泡; 细胞骨架; 内膜; 微管; 线粒体
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。

使用信息

稀释比例
WB1: 1000 IF1:1600 - 1:3200 FCM1:200

抗体应用
WB, IF, F

抗体类型
Rabbit

反应性
Human

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
14 kDa, 16 kDa

阳性对照	HCT 116 (Chloroquine, 50 μM, 18 h); Hela
阴性对照

样品处理数据示例

样品	处理情况
HCT116	Chloroquine (50 μM, 18 h)
点击查看更多样品数据

^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
实验步骤：电泳分离 1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳； 2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.电源200mA，100分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）封闭(可选) 1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟； 2.在封闭液中孵育膜1小时,室温； 3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。抗体孵育 1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 1000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2.用TBST洗膜3次,每次5分钟； 3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时； 4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。显色 1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀； 2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

电泳分离

1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳；

2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.电源200mA，100分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）

封闭(可选)

1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟；

2.在封闭液中孵育膜1小时,室温；

3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。

抗体孵育

1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 1000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2.用TBST洗膜3次,每次5分钟；

3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时；

4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

显色

1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀；

2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。

IF
实验步骤：标本制备 1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。 2. 室温固定细胞 15 分钟。 3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。 4. 继续进行免疫染色。免疫染色 1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。 2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。 3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。 4. 4°C 孵育过夜。 5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。 7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。 9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

实验步骤：

标本制备

1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。

注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

2. 室温固定细胞 15 分钟。

3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。

4. 继续进行免疫染色。

免疫染色

1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。

2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。

3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。

4. 4°C 孵育过夜。

5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。

7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。

9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
LC3B Rabbit mAb 可检测内源性 LC3B 总的蛋白水平。

Uniprot ID
Q9GZQ8

克隆号
G7J7

背景
自噬(Autophagy)是一个高度保守的过程，其中蛋白质和细胞器经历降解。这些受损的成分随后被去除并通过溶酶体回收。在多种自噬相关基因（Atgs）的调控下，自噬最终导致自噬体的形成。 LC3（微管相关蛋白 1 轻链 3）是该过程中的重要蛋白，可作为自噬标记物。最初被鉴定为微管相关蛋白 1B (MAP1LC3) 的一个亚基，被命名为 LC3B。在自噬过程中，三种人类 LC3 亚型（LC3A、LC3B 和 LC3C）会发生翻译后修饰。 LC3 最初合成，然后在羧基末端裂解，产生胞质 LC3-I 形式。当自噬体形成时，可溶性 LC3B-I 通过涉及 Atg7 和 Atg3 的泛素样系统促进的脂化转化为自噬囊泡相关形式 (LC3B-II)。这种修饰使 LC3 能够与自噬囊泡结合，使其成为自噬的可靠指标。

背景

自噬(Autophagy)是一个高度保守的过程，其中蛋白质和细胞器经历降解。这些受损的成分随后被去除并通过溶酶体回收。在多种自噬相关基因（Atgs）的调控下，自噬最终导致自噬体的形成。 LC3（微管相关蛋白 1 轻链 3）是该过程中的重要蛋白，可作为自噬标记物。最初被鉴定为微管相关蛋白 1B (MAP1LC3) 的一个亚基，被命名为 LC3B。在自噬过程中，三种人类 LC3 亚型（LC3A、LC3B 和 LC3C）会发生翻译后修饰。 LC3 最初合成，然后在羧基末端裂解，产生胞质 LC3-I 形式。当自噬体形成时，可溶性 LC3B-I 通过涉及 Atg7 和 Atg3 的泛素样系统促进的脂化转化为自噬囊泡相关形式 (LC3B-II)。这种修饰使 LC3 能够与自噬囊泡结合，使其成为自噬的可靠指标。

参考文献
[1] Huang J, et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2015 Dec;66(6):576-83.

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