NVP-BSK805 2HCl
别名: BSK805
NVP-BSK805 2HCl是一种有效的，选择性的，ATP竞争性的JAK2抑制剂，IC50为0.5 nM，比作用于JAK1， JAK3和TYK2选择性高20倍以上。
NVP-BSK805 2HCl Chemical Structure
CAS: 1942919-79-0
产品质控
批次：
纯度：
99.95%
99.95
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生物活性
| 产品描述 | NVP-BSK805 2HCl是一种有效的，选择性的，ATP竞争性的JAK2抑制剂，IC50为0.5 nM，比作用于JAK1， JAK3和TYK2选择性高20倍以上。 | ||||||||
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| 靶点 |
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| 体外研究(In Vitro) | ||||
| 体外研究活性 | NVP-BSK805是JAK2强有效的抑制剂，且对JAK2的特异性很好，其对JAK2的抑制效果比对JAK1, JAK3和TYK2要强20倍。0.5 nM 的NVP-BSK805对全长JAK2V617F和野生型JAK2酶产生一半的最大抑制效果。NVP-BSK805阻断JAK2V617F细胞(Ba/F3)的生长，且诱导细胞凋亡，其GI50在＜100 nM的浓度。STAT5磷酸化作用是依赖JAK2的基本的磷酸化作用，在JAK2 V617F突变的细胞中，大于等于100 nM的 NVP-BSK805像MB-02一样能显著抑制STAT5的磷酸化作用。分别用150 nM和1µM的NVP-BSK805孵育SET-2细胞，分别能抑制75%和95%的细胞生长，且在这两个浓度下培养24, 48和72小时，发现会引起浓度和时间依赖的细胞凋亡。可以检测裂开的PARP、Bcl-xL表达的减少和急剧增加的DNA含量少于2N的细胞数量，通过检测这些确定结果。[1] NVP-BSK805引起的细胞凋亡是需要通过激活凋亡蛋白级联反应来实现的，而当在SET-2和MB-02细胞中抑制细胞凋亡蛋白酶caspase则可以抑制这种NVP-BSK805引起的细胞凋亡。在JAK2V617F细胞, SET-2和MB-02细胞中，NVP-BSK805能调节Bim的翻译后修饰和Mcl-1的水平。[2] | |||
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| 激酶实验 | 酶活性分析 | |||
| 构建含有人的JAK2激酶结构域（840-1132位氨基酸）的质粒pAcG2TtevJAK2。分别设计构建了JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187)和JAK1(866-1154)的质粒。通过产品手册(BD Biosciences Pharmingen)构建含有BD BaculoGoldTM Bright线性DNA的融合杆状病毒，空斑实验以及单一斑块病毒扩增实验。用100 mL加了青霉素/链霉素(Sigma)的 ExCell420培养基(JRH Biosciences Ltd)在27 ℃培养Sf9细胞48小时，用于表达Janus激酶结构域。在悬浮培养的细胞浓度在1 × 106时进行感染，用感染病毒后可溶性蛋白的产量优化每个病毒的感染复数(MOI)。分别在MOI为1和0.5的时候表达人的JAK2的激酶结构域和JAK1, JAK3和TYK2的激酶结构域。27 ℃下培养48小时表达JAK2，而JAK1, JAK3和TYK2则需48或72小时表达。感染后48小时或72小时后，将100 mL表达培养基用3000 ×g离心5分钟收集细胞，用12 mL裂解缓冲液裂解细胞，缓冲液成分为50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM原钒酸钠, 1 % Triton X-100, 10 % 甘油, 1× 不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics)和12.5 U/mL Benzonase。4℃孵育30分钟，14,000 × g离心45分钟分离颗粒性不可溶物质。然后在4 ℃下用GST标签亲和纯化蛋白激酶结构域。将之前离心所得的上清与0.2 mL含有50 %的谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B的悬浮液在4 ℃下孵育2小时，然后用1 mL含有50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM DTT和10 %甘油的缓冲液洗5次。用0.25 mL的洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1mM DTT, 10 % 甘油, 10 mM还原性L-谷胱甘肽)洗脱结合到胶上的蛋白，分5次洗脱，每次孵育10分钟。用Amicon Ultra-4离心超滤管浓缩洗脱液到五分之一的体积。加入终浓度0.1 %的Brij35后，将蛋白分成小份，置于-80℃速冻保存，在这种储存条件下其激酶活性能保持至少6个月。在含有0.1 μM [γ33P]-ATP, 1 mM MnCl2, 5 mM MgCl2, 30 μM合成的多肽底物EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0.01 % Brij35和50 mM Tris-HCl pH 7.5的缓冲体系中加入JAK激酶结构域作为酶，室温孵育30分钟。对于所有的蛋白ATP的浓度都低于其Km值。用XLfit® (型号205)的逻辑斯谛方程和全局拟合功能对曲线进行非线性回归拟合。像激酶实验的条件一样全长野生型JAK2及其突变体V617F的表达及鉴定，实验方法在其他地方已经介绍了。用内源激酶通路分析NVP-BSK805的激酶选择性实验，在Caliper实验中，在电场中当多肽底物被磷酸化后会有不同的迁移速度，以此来检测激酶实验。多肽带有荧光标签，可以在毛细管系统中用于检测、离子交换及定量。用LC3000仪器(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)对多肽的荧光进行定量。激酶实验中激酶的活性可以通过检测剩余的ATP的数量来定量。LanthaScreenTM TR-FRET激酶实验中，铽元素当做镧系元素螯合物融合了抗磷酸化底物的抗体。 | ||||
| 细胞实验 | 细胞系 | Ba/F3细胞 | ||
| 浓度 | 100 nM | |||
| 孵育时间 | 72小时 | |||
| 方法 | 可以通过比色分析试剂盒WST-1 (Roche Diagnostics GmbH)来检测细胞存活率，用于分析对比用8点浓度范围的药物培养72小时后细胞的存活情况以及用DMSO处理细胞后产生相关的细胞增殖变化情况，这样可以检测JAK2抑制剂抑制细胞增殖的能力。重复三次后，计算平均值，XLfit 4 软件绘图，可以得到抑制最大生长一半(GI50)的数值。 | |||
| 实验图片 | 检测方法 | 检测指标 | 实验图片 | PMID |
| Western blot | p-STAT5 / STAT5 / PARP / Cleaved Caspase-3 / Cleaved caspase-7 / Cleaved Caspase-8 / Cleaved Caspase-9 / Bim / Mcl-1 p-JAK2 / JAK2 |
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21247487 | |
| 体内研究(In Vivo) | ||
| 体内研究活性 | 口服NVP-BSK805生物药的利用效率在小鼠体内的实验估计为45%，在大鼠实验中估计为50%。给携带Ba/F3 JAK2V617F细胞的小鼠模型口服150 mg/kg的NVP-BSK805能抑制STAT5的磷酸化，脾肿大及白血病细胞的扩散。给BALB/c小鼠口服25, 50和100 mg/kg剂量的NVP-BSK805，能抑制rhEpo诱导的STAT5磷酸化反应和rhEpo调节的红细胞增多和脾肿大。[1] | |
|---|---|---|
| 动物实验 | Animal Models | RhEpo诱导的红血球增多症的雌性BALB/c小鼠 |
| Dosages | 50, 75和100 mg/kg | |
| Administration | 每天口服一次 | |
化学信息&溶解度
| 分子量 | 563.47 | 分子式 | C27H28F2N6O.2HCl |
| CAS号 | 1942919-79-0 | SDF | Download NVP-BSK805 2HCl SDF |
| Smiles | C1CNCCC1N2C=C(C=N2)C3=NC4=C(C=CC=C4N=C3)C5=CC(=C(C(=C5)F)CN6CCOCC6)F.Cl.Cl | ||
| 储存条件(自收到货起) | |||
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体外溶解度 |
DMSO : 100 mg/mL ( (177.47 mM) ；DMSO吸湿会降低化合物溶解度，请使用新开封DMSO) Water : 100 mg/mL (177.47 mM) Ethanol : 6 mg/mL (10.64 mM) |
摩尔浓度计算器 |
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体内溶解度 现配现用，请按从左到右的顺序依次添加，澄清后再加入下一溶剂 |
动物体内配方计算器 | ||||
实验计算
动物体内配方计算器（澄清溶液）
第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）
mg/kg
g
μL
只
第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系Selleck为您提供正确的澄清溶液配方）
% DMSO
%
% Tween 80
% ddH2O
%DMSO
%
计算结果：
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于μL DMSO溶液（母液浓度mg/mL，注：如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请先联系Selleck）；
体内配方配制方法：取μL DMSO母液，加入μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入μL ddH2O，混匀澄清。
体内配方配制方法：取μL DMSO母液，加入μL Corn oil，混匀澄清。
注意：1. 首先保证母液是澄清的；
2.一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
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