Phospho-IRS-1 (Ser 302) Rabbit mAb
目录号: F1489
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Lane 1: MCF7 (Insulin, 100 nM, 5 min)
Lane 2: C2C12 (Insulin, 100 nM, 5 min)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human , Mouse |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 180 kDa |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭（可选）
1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Phospho-IRS-1 (Ser 302) Rabbit mAb 可检测当 Ser 302 位点磷酸化时内源性 IRS-1 总的蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| K1C11 |
| 背景 |
|---|
胰岛素受体底物 1 (IRS-1) 在丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸化在调控胰岛素信号传导中起着至关重要的作用。IRS-1 是胰岛素受体激酶的主要底物，含有多个酪氨酸磷酸化位点，可作为含 SH2 结构域的蛋白质的对接平台，促进胰岛素的代谢和生长促进作用。IRS 蛋白的特点是具有多个相互作用结构域和磷酸化基序，但缺乏内在催化活性。每个 IRS 蛋白都具有一个 NH2 末端 pleckstrin 同源结构域，后跟一个磷酸酪氨酸结合结构域，这有助于将 IRS 蛋白与激活的受体（如胰岛素、IGF-I 和 IL-4 的受体）连接起来。胰岛素是代谢调控的核心，因为它促进肌肉和脂肪细胞对营养物质的吸收和储存，同时抑制肝脏中的糖异生。有多种机制可以调控胰岛素信号通路，包括细胞因子诱导的丝氨酸磷酸化、IRS 蛋白降解或直接抑制胰岛素受体。IRS-1 有超过 20 个潜在的丝氨酸磷酸化位点，可被各种激酶靶向。例如，Ser302 的磷酸化是胰岛素诱导的 IRS-1 酪氨酸磷酸化的必要条件，可能将胰岛素信号与营养物质的可用性联系起来。同时，PKCθ 介导的 IRS-1 Ser1101 磷酸化抑制了胰岛素信号，为某些肥胖模型中观察到的胰岛素抵抗提供了可能的解释。 |
| 参考文献 |
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