Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) Rabbit mAb

目录号: F0198

Filter:

Lane 1: MCF7
Lane 2: MCF7 (IGF-1,100 ng/mL,10 min)
Lane 3: MCF7 (IGF-1,100 ng/mL,10 min; λ phosphatase)
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human breast cancer tissue with F0198 at 1/100 dilution.

规格	价格	库存
20ul	790	现货
50uL	1240	现货
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100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
蛋白定位
细胞质; 细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。

使用信息

稀释比例
WB1: 2000 IHC1:200 - 1:800 IF1:50 - 1:100 FCM1:50 - 1:200

抗体应用
WB, IHC, IF, F

抗体类型
Rabbit

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey, Mink, S. cerevisiae

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
32 Kda

阳性对照	Human colon carcinoma; Human lung carcinoma; Human breast carcinoma; Mouse spleen; MCF7 (hIGF-1, 100 ng/mL, 10 min); LNCaP; A549
阴性对照

样品处理数据示例

样品	处理情况
MCF7	hIGF-1 (100 ng/mL, 10 min)
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^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
实验步骤：电泳分离 1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳； 2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.电源200mA，100分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）封闭(可选) 1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟； 2.在封闭液中孵育膜1小时,室温； 3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。抗体孵育 1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 2000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2.用TBST洗膜3次,每次5分钟； 3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时； 4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。显色 1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀； 2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

电泳分离

1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳；

2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.电源200mA，100分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）

封闭(可选)

1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟；

2.在封闭液中孵育膜1小时,室温；

3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。

抗体孵育

1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 2000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2.用TBST洗膜3次,每次5分钟；

3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时；

4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

显色

1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀；

2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。

IF
实验步骤：标本制备 1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。 2. 室温固定细胞 15 分钟。 3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。 4. 继续进行免疫染色。免疫染色 1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。 2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。 3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。 4. 4°C 孵育过夜。 5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。 7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。 9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

实验步骤：

标本制备

1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。

注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

2. 室温固定细胞 15 分钟。

3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。

4. 继续进行免疫染色。

免疫染色

1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。

2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。

3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。

4. 4°C 孵育过夜。

5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。

7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。

9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

IHC
实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

IHC

实验步骤：

脱蜡/补液

1. 脱蜡/水合切片：

2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。

3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。

4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。

5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。

5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。

6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。

7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。

9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。

11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。

12. 将载玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用苏木精复染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。

16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) Rabbit mAb 用于检测当 Ser235/236 位点磷酸化时内源性总 Phospho-S6 Ribosomal Protein 的水平。

别名
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236),RPS6 (phospho S235 + S236)

Uniprot ID
P62753

克隆号
G7G11

背景
生长因子(Growth factors)和有丝分裂原(mitogens)通过上调 mRNA 翻译有效刺激持续的细胞生长和增殖。 p70 S6 激酶的激活和随后 S6 核糖体蛋白的磷酸化是该过程中的关键事件。 S6 核糖体蛋白的磷酸化导致 5' 非翻译区含有寡嘧啶束的 mRNA 转录本的翻译增强。这些转录本被称为 5'TOP，编码对细胞周期进展至关重要的蛋白质，以及翻译所必需的核糖体蛋白质和延伸因子。高度同源的 40S 核糖体蛋白 S6 激酶（S6K1 和 S6K2）通过控制构成蛋白质合成装置的翻译成分（尤其是核糖体蛋白）的生物合成，在细胞生长调节中发挥关键作用。

背景

生长因子(Growth factors)和有丝分裂原(mitogens)通过上调 mRNA 翻译有效刺激持续的细胞生长和增殖。 p70 S6 激酶的激活和随后 S6 核糖体蛋白的磷酸化是该过程中的关键事件。 S6 核糖体蛋白的磷酸化导致 5' 非翻译区含有寡嘧啶束的 mRNA 转录本的翻译增强。这些转录本被称为 5'TOP，编码对细胞周期进展至关重要的蛋白质，以及翻译所必需的核糖体蛋白质和延伸因子。高度同源的 40S 核糖体蛋白 S6 激酶（S6K1 和 S6K2）通过控制构成蛋白质合成装置的翻译成分（尤其是核糖体蛋白）的生物合成，在细胞生长调节中发挥关键作用。

参考文献
[1] Dufner A, et al. Exp Cell Res. 1999 Nov 25;253(1):100-9. [2] Peterson RT, et al. Curr Biol. 1998 Mar 26;8(7):R248-50.

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