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Lane 1: 293
Lane 2: 293 (UV-treated)
Lane 3: NIH/3T3
Lane 4: NIH/3T3 (UV-treated)
客户使用该产品的1个实验数据
WB
操作要点
蛋白定位：细胞质; 细胞核; 突触。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat, D. melanogaster, S.Cerevisiae |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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46 kDa, 54 kDa
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| 阳性对照 | Human lung carcinoma; 293T (UV-treated); NIH/3T3 (UV-treated); C6 (anisomycin-treated) |
|---|---|
| 阴性对照 | 293T (untreated); NIH/3T3 (untreated); C6 (untreated) |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 |
| 293T | UV treatment |
| NIH/3T3 | UV treatment |
| C6 | Anisomycin treatment |
| 点击查看更多样品数据 | |
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤： 脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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仅当 Thr183 和 Tyr185 位点发生磷酸化时，Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) Rabbit mAb 才可检测内源性总 Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) 的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| Phospho SAPK (Thr183), Phospho JNK (Tyr185) |
| Uniprot ID |
|---|
| P45983 |
| 克隆号 |
|---|
| H4H3 |
| 背景 |
|---|
应激激活蛋白激酶/c-Jun N 端激酶 (SAPK/JNK) 是 MAPK 信号通路的重要组成部分，主要由环境应激激活，例如紫外线和伽马射线、神经酰胺、炎性细胞因子，偶尔也由生长因子和 GPCR 激动因子激活。JNK 的激活涉及一系列磷酸化事件，从 MAPKKK（如 MEKK1-4）或混合谱系激酶 (MLK) 开始，进而激活 MKK4/7。这些 MAPK 激酶随后在 Thr183 和 Tyr185 位点磷酸化 JNK，这种修饰称为磷酸化 SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）。这种双重磷酸化对于 JNK 激活及其随后通过与 c-Jun 和 ATF-2 等转录因子相互作用调控转录至关重要。一旦被激活，JNK 就会形成二聚体并易位到细胞核中，影响与应激反应、细胞凋亡和炎症相关的基因表达。它是研究 JNK 在细胞信号传导和疾病过程中的作用的关键标记。 |
| 参考文献 |
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技术支持
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