Phospho-SMAD1 + SMAD5 + SMAD9 (Ser 463 + Ser 465 + Ser 467) Rabbit mAb

目录号: F2875

Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (BMP-4 treated)
Lane 3: HeLa (BMP-4 and phosphatase treated)
Lane 4: Mouse brain
Lane 5: Rat brain

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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操作要点

蛋白定位：细胞质; 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-246 Lysis Buffer 制备裂解物。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IHC1:100 - 1:800

抗体应用
WB, IHC

抗体类型
Rabbit

反应性
Human, Mouse, Rat

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
58 kDa

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Phospho-SMAD1 + SMAD5 + SMAD9 (Ser 463 + Ser 465 + Ser 467) Rabbit mAb 用于检测当 Ser 463 + Ser 465 + Ser 467 位点磷酸化时内源性 Phospho-SMAD1 + SMAD5 + SMAD9 (Ser 463 + Ser 465 + Ser 467) 总的蛋白水平。

别名
Phospho-Smad1 (Ser463/465)/ Smad5 (Ser463/465)/ Smad9 (Ser465/467)

克隆号
K12G16

背景
SMA和SMAD1也称为 JV4-1、MADH1 或 MADR1，是位于人类 5q4 染色体上的基因。SMAD1 最初是在研究与乳腺癌相关的基因时发现的，此后被认为是肿瘤进展的关键调控因子。它是 TGF-β 信号传导的关键介质，在细胞生长、凋亡、发育和免疫应答等过程中起着至关重要的作用。SMAD1 与各种恶性肿瘤的发展有关，充当骨形态发生蛋白 (BMP) 信号的转导器，影响广泛的细胞功能，包括增殖、凋亡、发育和免疫调控。BMP 配体通过 BMP 受体激酶的磷酸化激活 SMAD1。一旦磷酸化，SMAD1 就会与 SMAD4 形成复合物，SMAD4 会迁移到细胞核中，与特定转录共同调控基因转录因素。SMAD1 已被证明可促进多种癌症类型的细胞侵袭和转移。例如，其过表达促进胃癌细胞对 BMP-7 的增殖，并在 BMP-9 激活后增强卵巢癌细胞的生长。BMP 受体是 Ser/Thr 激酶受体 TGF-β 超家族的一部分，在此信号级联中起着核心作用。配体结合触发受体多聚化、自磷酸化和活化。然后，活化的受体在其羧基末端区域的 SSXS 基序内的特定丝氨酸残基 (Ser463 和 Ser465) 处磷酸化 SMAD1。SMAD5 和 SMAD9（也称为 SMAD8）中也发生了类似的磷酸化。这些磷酸化的 SMAD 蛋白随后与辅激活因子 SMAD4 形成二聚体并转移到细胞核中，在那里它们调控靶基因的转录。

背景

SMA和SMAD1也称为 JV4-1、MADH1 或 MADR1，是位于人类 5q4 染色体上的基因。SMAD1 最初是在研究与乳腺癌相关的基因时发现的，此后被认为是肿瘤进展的关键调控因子。它是 TGF-β 信号传导的关键介质，在细胞生长、凋亡、发育和免疫应答等过程中起着至关重要的作用。SMAD1 与各种恶性肿瘤的发展有关，充当骨形态发生蛋白 (BMP) 信号的转导器，影响广泛的细胞功能，包括增殖、凋亡、发育和免疫调控。BMP 配体通过 BMP 受体激酶的磷酸化激活 SMAD1。一旦磷酸化，SMAD1 就会与 SMAD4 形成复合物，SMAD4 会迁移到细胞核中，与特定转录共同调控基因转录因素。SMAD1 已被证明可促进多种癌症类型的细胞侵袭和转移。例如，其过表达促进胃癌细胞对 BMP-7 的增殖，并在 BMP-9 激活后增强卵巢癌细胞的生长。BMP 受体是 Ser/Thr 激酶受体 TGF-β 超家族的一部分，在此信号级联中起着核心作用。配体结合触发受体多聚化、自磷酸化和活化。然后，活化的受体在其羧基末端区域的 SSXS 基序内的特定丝氨酸残基 (Ser463 和 Ser465) 处磷酸化 SMAD1。SMAD5 和 SMAD9（也称为 SMAD8）中也发生了类似的磷酸化。这些磷酸化的 SMAD 蛋白随后与辅激活因子 SMAD4 形成二聚体并转移到细胞核中，在那里它们调控靶基因的转录。

参考文献
[1] Wu J, et al. Biomark Res. 2021 Jun 16;9(1):48. [2] Whitman M. Genes Dev. 1998 Aug 15;12(16):2445-62.

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%