Phospho-SMAD1/ SMAD5/ SMAD9 (Ser 463/ Ser 465/ Ser 467) Rabbit mAb
目录号: F2875
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Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (BMP-4 treated)
Lane 3: HeLa (BMP-4 and phosphatase treated)
Lane 4: Mouse brain
Lane 5: Rat brain
操作要点
蛋白定位：细胞质, 线粒体, 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
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| 58 kDa |
| 阳性对照 | Human tonsil; Human cervical carcinoma; Human hepatocellular carcinoma; Human breast carcinoma; Human glioma; Mouse brain; Rat brain; Rat liver; HeLa (treated with BMP-4) |
|---|---|
| 阴性对照 | HeLa |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 |
| HeLa | BMP-4-treated |
| 点击查看更多样品数据 | |
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
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Phospho-SMAD1/ SMAD5/ SMAD9 (Ser 463/ Ser 465/ Ser 467) Rabbit mAb 用于检测 当 Ser 463 + Ser 465 + Ser 467 位点磷酸化时内源性 Phospho-SMAD1 + SMAD5 + SMAD9 (Ser 463 + Ser 465 + Ser 467) 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
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| Phospho-Smad1 (Ser463/465)/ Smad5 (Ser463/465)/ Smad9 (Ser465/467) |
| Uniprot ID |
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| Q99717 |
| 克隆号 |
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| K12G16 |
| 背景 |
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SMA和SMAD1也称为 JV4-1、MADH1 或 MADR1，是位于人类 5q4 染色体上的基因。SMAD1 最初是在研究与乳腺癌相关的基因时发现的，此后被认为是肿瘤进展的关键调控因子。它是 TGF-β 信号传导的关键介质，在细胞生长、凋亡、发育和免疫应答等过程中起着至关重要的作用。SMAD1 与各种恶性肿瘤的发展有关，充当骨形态发生蛋白 (BMP) 信号的转导器，影响广泛的细胞功能，包括增殖、凋亡、发育和免疫调控。BMP 配体通过 BMP 受体激酶的磷酸化激活 SMAD1。一旦磷酸化，SMAD1 就会与 SMAD4 形成复合物，SMAD4 会迁移到细胞核中，与特定转录共同调控基因转录因素。SMAD1 已被证明可促进多种癌症类型的细胞侵袭和转移。例如，其过表达促进胃癌细胞对 BMP-7 的增殖，并在 BMP-9 激活后增强卵巢癌细胞的生长。BMP 受体是 Ser/Thr 激酶受体 TGF-β 超家族的一部分，在此信号级联中起着核心作用。配体结合触发受体多聚化、自磷酸化和活化。然后，活化的受体在其羧基末端区域的 SSXS 基序内的特定丝氨酸残基 (Ser463 和 Ser465) 处磷酸化 SMAD1。SMAD5 和 SMAD9（也称为 SMAD8）中也发生了类似的磷酸化。这些磷酸化的 SMAD 蛋白随后与辅激活因子 SMAD4 形成二聚体并转移到细胞核中，在那里它们调控靶基因的转录。 |
| 参考文献 |
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